狂犬病病毒CTN-1株G蛋白的原核表达及基本功能评价

目的原核表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)CTN-1株G蛋白,并评价其基本功能。方法采用RT-PCR法扩增RV CTN-1株G蛋白基因,插入原核表达载体p GEX-5X-1,构建重组表达质粒p GEX-5X-1-CTN,转化入Rosetta(DE3)p Lys S,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,采用间接ELISA法检测其与阳性血清的结合性能及亲和力。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;纯化的重组蛋白RV-G相对分子质量约85 000,纯度可达85%,能与阳性血清特异性结合,且具有较好的区分性,与阳性血清的亲和力常数为1.2×1010 M-1。结论成功原核表达、纯化获得了纯度较高、特异性较好、亲和力较强、灵敏度较高的RV CTN-1株G蛋白,为研究G蛋白的抗原表位、建立针对RV G蛋白的ELISA抗体检测方法及其中和抗体的分选检测奠定了基础。     

一种肺炎链球菌重组蛋白PsaA-PspA23原核表达载体的构建及表达

目的优化肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23的同源区序列,阻止该基因的组氨酸标签(His-tag)融合表达,对突变后的目的基因进行表达及鉴定。方法以肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23为模板,设计2对具有重叠区的特异性引物,并分别对该重组基因进行扩增,得到Psa A-Psp A2和Psp A3的CDR区(亚类决定区)基因片段。利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术,将Psa A-Psp A2基因片段和Psp A3的CDR区基因片段连接,得到同源区优化后的基因片段。利用PCR技术扩增同源区优化后的基因片段,使该基因3′末端引入终止密码子,阻止Psa APsp A23基因表达载体上His-tag的融合表达。将得到的片段同源区优化且无His-tag融合表达的目的基因连接至p ET20b载体后,转入大肠埃希菌(E.coli)中进行表达,表达产物进行Western blot分析。结果重组表达质粒p ET20b-Psa A-Psp A23经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;转化E.coli中,37℃,IPTG终浓度1 mmol/L诱导5 h,获得可溶性表达的重组蛋白,且无His-tag。结论 Psa A-Psp A23蛋白基因同源区优化及His-tag成功去除,并在原核表达系统E.coli中可溶性表达,可为Psa A-Psp A23蛋白疫苗的进一步研究奠定基础。     

抗菌肽(tachyplesin Ⅰ)串联基因的构建、表达及抗菌活性

为了实现通过基因工程方法制备具有稳定结构的抗菌肽tachyplesin Ⅰ,采取了tachyplesinⅠ基因串联表达的方法.实验以高拷贝穿梭表达载体pSBPTQ为表达载体,通过RT-PCR扩增tachyplesin Ⅰ基因(tac)和采用直接退火的方法合成tachyplesin Ⅰ串联基因(2tac).构建重组表达载体pSBPTQ-TAC和pSBPTQ-2TAC,转化到枯草杆菌WB800实现高效表达,经2％蔗糖诱导获得表达串联产物(2TAC)和TAC.通过离子交换柱层析纯化后得表达产物2TAC和TAC,2TAC经BrCN水解后,对表达产物抑菌活性分析,观察发酵液上清对大肠杆菌(E.coli K88)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的抑菌圈和细胞微观形态的变化.实验结果表明:基因tac和2tac在枯草杆菌中表达成功,表达产物在发酵上清液中的含量分别约为8.25、17.36 mg·L-1;表达产物TAC和2TAC对大肠杆菌K88和伤寒沙门氏菌都具有明显的抑菌作用,2TAC经BrCN水解产物抑菌活力高于TAC.     

HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达。方法用PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段;分别合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS57个T或Th细胞表位基因;PCR方法将羧基端部分缺失的HCV核心区基因与合成的表位基因串联,克隆入真核表达载体pcDNA3·1(-),并通过脂质体瞬时转染COS7细胞。结果所构建的真核表达载体pcDNA3·1(-)-CtEm已成功转染COS7,间接免疫荧光和RT-PCR证实,pcDNA3·1(-)-CtEm可在COS7中表达复合多表位基因。结论已成功构建HCV复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达,为进一步复合多表位的基因免疫奠定基础。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的　在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法　以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果　重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。结论　为基因工程SS大肠杆菌疫苗的研制奠定了基础     

基于高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA差异表达分析

目的高通量测序技术分析冷应激大鼠肝脏基因mRNA差异表达。方法将SPF级大鼠随机分为冷刺激组[(4±0. 05)℃]及常温对照组[(24±0. 05)℃],刺激24 h。采集2组大鼠肝脏组织并提取总RNA,应用Ⅲumina HiSeg平台测序,对筛选的差异表达基因进行基因功能(Gene Ontology,GO)注释及信号通路数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,采用qRT-PCR验证随机筛选的基因mRNA表达水平。结果经测序分析,冷刺激组发掘新基因293个,其中244个有功能注释,差异表达基因98个;经GO分析,差异表达基因显著富集细胞过程、生物调控、代谢过程、细胞组分、细胞器、蛋白质运输等过程;经KEGG分析,大多数差异表达基因注释在原发性免疫缺陷、癌症形成过程、用于IgA生成的肠道免疫网络、细胞因子与细胞因子受体相互作用等通路,在MAPK、PI3K-Akt信号通路和内质网蛋白加工通路中表达量极高,在乙型肝炎和病毒感染通路表达量较低。与常温对照组比较,冷刺激组大鼠肝脏的多配体聚糖4(syndecan 4,Sdc4)及白蛋白(albumin,Alb)基因表达水平上调,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论成功筛选冷应激大鼠肝脏差异表达基因,该类基因很可能参与了机体代谢及损伤修复等过程,为深入研究大鼠冷应激机制积累了数据。     

人β-NGF真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性

目的在CHO细胞中共表达二氢叶酸还原酶(DHFR)基因及人神经生长因子β亚基(-βhNGF)基因,并对表达产物进行鉴定和生物活性分析。方法克隆DHFR和-βhNGF基因,测序,酶切,连接到真核表达载体pBudCE4.1中,构建人NGF基因重组表达质粒pBudCE4.1/DHFR/-βhNGF,经电转染法导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)中,经添加Zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选,获得了DHFR+细胞克隆。经MTX加压筛选高表达-βhNGF的CHO细胞株。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行鉴定,并利用鸡胚背根神经节法检测表达蛋白的生物活性。结果人神经生长因子在CHO细胞中得到较高表达,表达量达0.3μg/ml,且表达产物具有良好的生物活性。结论为大规模工业化生产重组人神经生长因子奠定了基础。     

重组核酸酶原核表达载体的构建

目的构建重组核酸酶原核表达载体,并检测其表达情况。方法根据Gen Bank公布的黏质沙雷菌胞外核酸酶(Serratia marcescens nuclease,SM nuclease)基因序列(M19495.1),去除其N-端信号肽序列,使用大肠埃希菌偏爱性密码子,设计并合成带有核酸酶基因的Ben-p GH。以核酸酶基因全长为模板,PCR法扩增该基因,将其与经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的A10-p ET-32a-c(+)载体连接,连接产物转入E.coli Top10中,经菌液PCR筛选阳性克隆,并进行DNA测序。将Ben-p ET-32a-c(+)转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果 Ben-p ET-32a-c(+)中核酸酶基因与Gen Bank公布的SM nuclease基因的同源性为82%。表达的重组核酸酶以包涵体形式存在,相对分子质量为30 000,表达量约占菌体总蛋白的84.45%。结论成功构建了重组核酸酶原核表达载体,并获得稳定表达。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

人巨细胞病毒融合表达载体的构建及鉴定

目的构建含人巨细胞病毒(HCMV)gB680糖蛋白基因和突变的pp65蛋白基因(pp65m)的融合表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达。方法用PCR法从HCMV基因组中钓取gB680和pp65m蛋白基因,分别亚克隆入pMD18-T载体中,经酶切鉴定并测序后,构建真核表达载体pVAX1/gB680+pp65m,以ELISA法检测其在COS-7细胞中的瞬时表达。结果重组质粒含有gB680和pp65m融合基因,并能在COS-7细胞中表达。结论已成功构建了人巨细胞病毒融合表达载体,并可在真核细胞中表达。     

双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素(HA)基因真核表达质粒,并在HeLa细胞中进行表达。方法通过PCR分别改造流感病毒H1亚型HA1和H3亚型HA基因片段,在融合片段间引入(G4S)3柔性linker和口蹄疫病毒2A蛋白linker。采用DNAstar结合生物信息学软件InsightⅡ分析后,对其空间构象进行模拟。将H1HA1-H3HA融合基因片段克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游。通过脂质体法转染HeLa细胞,RT-PCR法检测转染细胞中目的基因mRNA的转录,间接免疫荧光检测转染细胞中目的蛋白的表达。结果表达双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H3HA-H1HA1经酶切和测序证明构建正确。转染重组质粒的HeLa细胞可检测到目的基因mRNA的转录和目的蛋白的表达。结论已成功构建了真核表达质粒pVAX1-H3HA-H1HA1,并可在HeLa细胞中正确转录与表达,为H3、H1亚型流感病毒双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白真核表达质粒的构建

目的克隆宫颈癌病理组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期蛋白(L1)的基因,并构建真核表达质粒,为制备预防性疫苗奠定基础。方法采用PCR法从宫颈癌病理标本中扩增出HPV16-L1基因,与pMD18T载体连接,测序并构建真核表达质粒(pVAX1L1),瞬时转染Cos7细胞,利用免疫组化技术检测表达产物。通过小鼠淋巴细胞转化试验检测免疫原性。结果所得L1基因的序列与GenBank中序列比较存在若干变异,并由此引起相应的氨基酸发生变化。pVAX1-L1瞬时转染Cos7细胞,经免疫组化技术检测到棕黄色免疫复合物的形成,说明有表达产物L1蛋白产生。淋巴细胞转化试验结果显示,试验组与对照组差异有显著意义。结论宫颈癌病理组织中HPV16L1基因序列存在一定程度的变异,所得L1基因表达产物具有生物学活性。     

LTB-MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白。方法应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性。结果重组工程菌可以表达相对分子质量约为54000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性。结论已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达。     

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建肿瘤抑制基因WWOX的真核表达载体,并观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达。方法采用RT-PCR法,从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因,将其克隆至pMD18-T载体上,测序后定向连接到真核表达载体pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-WWOX,并用脂质体转染至A549细胞中,采用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)与WWOX的融合蛋白在A549细胞中的表达。结果测序结果显示,RT-PCR法获得的WWOX全编码序列与GenBank中报道的序列一致。真核表达载体pEGFP-C1-WWOX转染A549细胞48h后,共聚焦显微镜观察到细胞中有绿色荧光呈现,RT-PCR观察到WWOX基因得到有效转录。结论已成功构建了肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体pEGFP-C1-WWOX,并在A549细胞中表达了WWOX和GFP融合蛋白。     

NA-1株鹅源副粘病毒M、F和HN蛋白基因的真核表达

目的获得鹅源副粘病毒(GPMV)NA-1株M、F和HN基因真核表达蛋白。方法将NA-1株GPMV经SPF鸡胚增殖、纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank登录的NA-1株GPMV基因组序列,设计3对特异性引物,利用RT-PCR法,分别扩增M、F和HN基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至pMD18-T-Simple载体,并进行酶切和序列测定。将目的片段克隆至pCI-neo表达载体,酶切鉴定正确的重组质粒,分别命名为pCI-M、pCI-F和pCI-HN。将重组表达质粒分别转染Vero细胞,用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达。结果RT-PCR法分别扩增出M、F和HN基因,大小与预期一致。克隆载体及表达载体酶切及测序鉴定正确;重组真核表达质粒转染Vero细胞后,荧光显微镜下可见特异性荧光。结论利用pCI-neo真核表达载体在Vero细胞中成功表达了NA-1株GPMV M、F和HN基因,为下一步研究该病毒的出芽机制以及各结构蛋白的功能奠定了基础。     

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体的构建及其在SP2/0细胞中的表达

目的构建牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中表达。方法利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64、esat-6基因和mpb64-ag85b融合基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcMAE。将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果真核表达质粒pcMAE经酶切鉴定及测序,证实构建正确,转染后SP2/0细胞膜上出现均质的蓝绿色荧光。结论已成功构建了牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中获得表达,为进一步研制牛结核病多基因融合DNA疫苗奠定了基础。