嗜酸乳杆菌胆盐水解酶的分离纯化及酶学性质

对嗜酸乳杆菌La-XH1产生的胆盐水解酶进行分离纯化,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明：嗜酸乳杆菌La-XH1胆盐水解酶的粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B柱层析后的酶比活力分别为47.82 U/mg和115.85 U/mg,纯化倍数分别为4.46 倍和10.82 倍,酶的回收率分别为59.89%和25.11%;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）电泳分析,该酶的分子质量约为43 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6.0,Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对该酶有激活作用,其中Fe3+的激活作用最强,Na+、K+对该酶几乎无作用,而Cu2+、Ba2+对该酶有很强的抑制作用。     

胆盐水解酶酶学性质与基因结构研究进展

胆盐水解酶（Bile salt hydrolase, BSH）广泛存在于哺乳动物胃肠道中,是肠道菌群在生长、繁殖过程中产生的一种胞内酶,可以调节宿主的胆汁酸平衡,影响脂质代谢,有控制胆固醇、调节肠道疾病的作用,并且BSH这种调控作用可以实现益生菌部分益生功能,因此BSH一直是研究热点。BSH结构和底物特异性的详细知识是开发BSH相关产品的坚实基础。本文介绍了BSH的来源及活性检测方法,BSH基因结构、酶学性质及底物识别机制,最后讨论了BSH在畜禽业食品工业及医药等方面的应用,期望为胆盐水解酶的深入研究及其在食品、保健品及医药方面的开发利用提供参考。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ胆盐水解酶的表达及其酶活力分析

以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-Ⅲ4种胆盐水解酶(BSHs)的编码序列(bsh 1～4),将其克隆至表达载体pET-28b(+)上,在原核系统进行表达,并对其酶活力进行测定,结果发现4种BSHs的酶活力分别为29.00、20.49、24.90、21.13U/mL。同时BSH1比其他3种BSHs表现出更高的水解能力。     

屎肠球菌132胆盐水解酶基因的克隆表达与酶学特性

该研究旨在探究降胆固醇潜在菌株屎肠球菌132胆盐水解酶（bile salt hydrolase,BSH）的活性,通过PCR技术克隆目的基因并在大肠杆菌BL21中表达,同时探讨其酶学特性。利用茚三酮法对其菌体破碎液BSH活性进行测定,比酶活达0.55 U/mg。通过克隆其目的基因,连接pET-28a(+)的表达载体并进行异源表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验显示,该酶分子量约37 ku。当底物为甘氨胆酸钠（glycocholic acid,GCA）、pH 5.50时,BSH酶活达4.93 U/mg。酶学特性结果表明,GCA为底物、pH 5.50、温度为30 ℃时达最适条件,BSH水解能力最强,酶活达6.59 U/mg,温度在4~30 ℃时,pH为5~7有较好的热稳定和pH稳定性。不同离子对酶活的影响实验表明Na+、Ca2+、Mg2+均对酶活有激活作用;Mn2+、Fe2+对酶活影响不大,但Ni2+、Al3+、Li2+、Co2+、Zn2+均对酶活有强抑制作用,比酶活降到10%以下,几乎丧失活性。通过酶反应动力学得出该酶的Vmax为6.44 μmol/(min?mg),Km值为3.16 mmol/L。因此,通过bsh基因克隆并异源表达,提高了屎肠球菌132BSH活性,并且BSH水解各类胆盐能力较强,为降胆固醇功能食品的开发与应用奠定基础。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质分析

构建植物乳杆菌(Lactobacillus sp.LMY-20)中亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)的重组大肠杆菌、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。将人工合成的密码子优化的亚硝酸盐还原酶基因(nir)亚克隆至载体pET28a(+),构建重组表达载体p ET28a(+)-nir并转化到E.coli BL21(DE3)中实现表达。包涵体复性,利用镍柱亲和层析纯化重组亚硝酸盐还原酶。成功构建产亚硝酸盐还原酶的重组大肠杆菌并纯化了重组亚硝酸盐还原酶,纯化后经变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析在45 k Da附近出现明显条带。Na_2S_2O_4-MV法测得酶活为2 332.72 U/L,最适pH值为6.5,最适作用温度为37℃,在4～70℃下孵育40 min后可保持超过85%的活力。该研究实现植物乳杆菌来源的NiR在大肠杆菌中的重组表达、纯化及其酶学性质分析,重组NiR具有较好的温度适应性和稳定性,为其在农业、食品及医药等领域应用奠定基础。     

胆盐水解酶基因在植物乳杆菌ST-Ⅲ中的表达

胆盐水解酶（Bile salt hydrolase,BSH）是微生物生长、繁殖过程中产生的一种胞内酶,因其与降低血胆固醇、预防心血管疾病有关而受到广泛关注。本研究通过基因工程技术实现了4种胆盐水解酶基因在Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ的过表达,并利用茚三酮显色法测定了表达4种BSHs重组菌的酶活,结果显示表达BSH1重组菌的酶活最高,其次是BSH3和BSH2的重组菌,而以BSH4重组菌酶活最低。本研究结果表明,BSH1可能在L.plantarum ST-Ⅲ水解胆盐方面起着更为重要的作用,其次为BSH3,而BSH2和BSH4在L.plantarum ST-Ⅲ中对牛磺酸结合胆盐的水解能力较弱。      

4种胆盐水解酶在发酵乳杆菌AR497中的异源表达

为提高发酵乳杆菌耐胆盐能力,将植物乳杆菌AR113来源的4种BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3和BSH4)转化至发酵乳杆菌AR497中进行表达。结果表明,植物乳杆菌来源的4种BSH同功酶异源表达可提高发酵乳杆菌的耐胆盐能力。在2.0mg/mL甘氨脱氧胆酸钠浓度下,表达BSH2的工程菌致死率最低,其他菌株生长被完全抑制;BSH酶活测定表明,BSH2表达菌株酶活最高,达57.74U/mL,比对照空质粒菌株提高了2.88倍。     

氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全。酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法。从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌。通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 k Da。该酶最适反应温度为35℃,最适p H值为7.0,在10~45℃时,具有良好的热稳定性。以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1。金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶。此外,该酶对低浓度的Na Cl和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力。     

黑曲霉果糖基水解酶的重组表达及酶学特征分析

目的:果糖基转移酶在新型果糖基衍生品的制备过程中具有重要作用,获得酶活高、性能优良的果糖基水解酶是关键。方法:利用MEGA 4.0以及Clustal X2等软件对黑曲霉的基因组进行分析,遴选了5个果糖基水解酶基因,接着将它们在毕赤酵母中进行了克隆表达,并研究了重组酶的酶学性质。结果:在摇瓶水平上,重组酶Fru1和Fru5的酶活分别为1360和1560 U/m L,远高于目前已报道的果糖基水解酶的酶活。重组酶Fru1的最适反应温度和p H分别为45℃和5.5,EDTA对它有微弱的促进作用,Fe²⁺、Na+、Co²⁺、Cu²⁺和Ca²⁺会轻微地抑制酶活,该酶对蔗糖既有水解作用,又有转苷活性,还可以水解菊粉中的二糖到五糖;重组酶Fru5的最适反应温度和p H分别为50℃和5.0,Li⁺、Na⁺和EDTA对其酶活有促进作用,但Fe²⁺则强烈抑制酶的活性,它还可以水解蔗糖以及菊粉中几乎所有的大分子糖。结论:本研究为果糖基水解酶的工业化生产及其在新型果糖基衍生品制备过程中的应用提供了可能途径。      

长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的异源表达及其酶学性质

为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶（Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase）合成2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G）的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表达,以BloSPase的水解酶活力为指标,通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化;并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明,BloSPase的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）浓度0.47 mmol/L、诱导温度23℃。在该条件下,水解酶活力可达到（730.35±0.58）U/mL,比酶活达到（95.22±2.45）U/mg。酶学性质研究显示,BloSPase转糖基化活力的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.2,在40、50℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km值为（266.80±23.76）mmol/L,Vmax值为（0.235 0...     

不同来源胆盐水解酶基因在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上报道的两歧双歧杆菌ATCC 29521的胆盐水解酶基因(BSH)序列和嗜酸乳杆菌NCFM的胆盐水解酶基因(BSHA和BSHB)序列,设计引物通过PCR扩增获得BSH基因,将其连接到表达载体pET28a(+),构建pETBSH表达质粒,经IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明在分子质量大小约40、43、45kD处有预期条带出现,初步表明蛋白表达成功。重组菌产生的胆盐水解酶水解甘氨胆酸钠产生的甘氨酸经茚三酮比色法分析,表明该重组的胆盐水解酶具有水解活性。     

胆盐水解酶的分离纯化与部分特性研究

为了给胆盐水解酶结构分析及降低血液胆固醇的机理研究提供理论基础,采用硫酸铵分级沉淀、透析、阴离子交换树脂层析等方法对分离自我国传统开菲尔粒中的1株干酪乳杆菌KTx(lactobillus casei KTx)产生的胆盐水解酶进行了纯化,并对其部分特性进行了研究.结果表明在70%的硫酸铵条件下酶蛋白能最大程度地沉淀.采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂层析,流速1.0 mL/min,用0.1 mol/L NaCl-50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.5)洗脱,比活力可达到115(AU/mg),是原粗酶液的17倍.纯化后的样品经SDS-PAGE电泳,初步确定了胆盐水解酶的分子质量约30 kDa.该酶的最适反应温度35℃,最适pH 6.0,最适反应底物浓度6mmol/L,酶促反应动力学常数4.57 mmol/L.抑制剂对此酶的抑制作用强弱顺序依次为尿素＞SDS＞EDTA.Al3 对此酶的激活能力最强,其次是Fe3 ,Zn2 对酶活无激活作用.     

胆盐水解酶基因在植物乳杆菌KLDS1.0386中的表达研究

本文从转录水平上研究了四种胆盐水解酶基因在植物乳杆菌KLDS1.0386中不同生长阶段的表达情况,并且分别以不同浓度的牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐为底物,以16s r RNA作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术研究不同浓度底物下的胆盐水解酶基因(bsh1、bsh2、bsh3、bsh4)表达的变化规律。结果显示,内参基因和目的基因的扩增效率均在90%~105%之间,说明目的基因的表达量可以被很好的反应出来。通过实时荧光定量PCR结果分析可知,植物乳杆菌KLDS1.0386中的4种胆盐水解酶基因随着生长时间的延长,表达量显著增加,而且在两种胆盐中都表达,基因表达量都被不同剂量(1%、2%、3%)的胆盐上调,上升幅度随着胆盐浓度的增加表现出极显著的增加趋势,而且胆盐不同,同浓度时每个基因的表达量也各不相同,在甘氨脱氧胆盐中的表达量普遍高于牛磺脱氧胆盐。     

大肠杆菌色氨酸酶的制备及酶学性质

以硫酸铵沉淀法分离提取大肠杆菌色氨酸酶,进行色氨酸酶学性质检测及动力学初步探讨。结果表明：使用50℃水浴法进行细胞壁的破碎,提取粗TPase 酶液效果较好;(NH₄)₂SO₄ 粗提色氨酸酶有较好效果;色氨酸酶的最佳反应pH 值为8.0,在pH5.5～7.5 较稳定;最高耐受温度65℃,最佳反应温度45℃;K⁺、NH⁴⁺ 能够明显地提高色氨酸酶活性,而Na+ 则明显地抑制酶活性。对色氨酸酶的动力学研究表明,在相同反应条件下,针对底物L- 丝氨酸的米式常数Km 值远远大于吲哚的Km 值。     

贝莱斯芽孢杆菌角蛋白酶的克隆表达、纯化及酶学性质

为了获得更好的羽毛粉降解酶，本文从贝莱斯芽孢杆菌基因组中筛选到一个角蛋白酶基因（baker1），对其克隆并在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达，最后对重组角蛋白酶（BaKer1）进行了分离纯化、表征及应用研究。实验结果表明，BaKer1的最适反应pH为9.5，最适反应温度为55℃，在中温和碱性条件下具有较好的稳定性。1 mmol/L Ca²⁺对BaKer1有显著地促进作用，5 mmol/L Mn²⁺对BaKer1有轻微地抑制作用，其他金属离子对BaKer1影响不大。PMSF对BaKer1的活性具有显著抑制作用，表明BaKer1是典型的丝氨酸蛋白酶。分别以羽毛粉、偶氮酪蛋白、酪蛋白为底物测定了BaKer1的动力学参数，K_m值分别为5.06、1.09和1.39 mmol/L，k_cat/K_m值分别为1 058.24、2 536.54和3 733.79·(s·mmol/L)。BaKer1处理羽毛粉，能达到酸水解效果的 33.51%，说明它在羽毛粉降解过程中具有潜在的应用价值。     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质

目的:研究大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质。方法:首先采用PCR技术克隆编码大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因gadA,并将该基因克隆至载体pET-28a(+)中,形成重组质粒pET28a-gadA;然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21,构建重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-gadA。进一步采用Ni~(2+)亲和层析色谱分离纯化谷氨酸脱羧酶A,研究其酶学性质。结果:经PCR和双酶切鉴定,重组质粒pET28a-gadA构建成功。SDS-PAGE分析表明Ni~(2+)亲和层析纯化后得到电泳纯级谷氨酸脱羧酶A,其比活力为19 U/mg,得率为12.8%。在pH 4.5时,谷氨酸脱羧酶A的酶活力最高。该酶的最适温度为50℃,且在40℃时有较高的热稳定性,70℃时热稳定性较差,酶活力仅为初始酶活的17.9%。Cu~(2+)对该酶的酶活力有较强的抑制作用,Ba~(2+)、Co~(2+)和Mg~(2+)对其酶活力影响不大,Ca~(2+)能显著增加该酶的酶活力。结论:研究结果为深入理解谷氨酸脱羧酶A的酶学性质及其γ-氨基丁酸的制备提供了试验基础。