驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6 株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L. plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。     

植物乳杆菌β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖及其体外乳酸菌增殖活性

利用植物乳杆菌来源的β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS),通过对乳糖浓度、反应温度、体系p H以及酶浓度等反应条件及其体外增殖乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)进行研究,确定酶法合成GOS及其各主要组分产量的最优条件并表征其益生功效。结果表明:乳糖浓度和反应温度的变化对于产物合成影响较大,为主要影响条件,而体系p H和酶浓度对于各产物最高产量的影响不显著,为次要影响条件。经过对反应条件进行优化,总产量与各组分产量的最优条件一致,为底物浓度400g/L,体系p H 7.0,10 U/mL的酶浓度,45℃水浴10 h。总GOS产量达到177.26 g/L,在体系中占44.31%(m/V)。其中异乳糖、6′-半乳二糖、6′-GOS和3′-GOS的产量分别是63.22 g/L、15.32 g/L、72.21 g/L和25.11 g/L。相比较主要以β(1→4)糖苷键连接的商业化低聚半乳糖(QHT-GOS),半乳糖残基以β(1→6)糖苷键连接为主的新合成GOS对于供试LAB增殖作用更为显著,表现在以较低的低聚糖比例(44.3%)达到与之高比例低聚糖(70%)相当的LAB生长密度,以及具有明显优势的最大比生长速率。     

产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及酶法合成低聚半乳糖的GC-MS分析

从分离自13种中国传统发酵食品的148株乳酸菌中筛选产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株。实验采用X-Gal平板初筛、薄层层析(TLC)复筛、气相色谱(GC)定量的方法,得到一株产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高的菌株,并以乳糖为单底物,利用该高转糖基活性β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖(GOS),并采用GC-MS的方法对其各个组分进行鉴定。研究结果表明,菌株70810所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,其合成GOS产率达到39.23%(m/m);该菌株为实验室已鉴定乳酸菌,为植物乳杆菌(HQ259238)(Lactobacillus plantarum);酶法合成的GOS产物鉴定为9种低聚二糖和3种低聚三糖,主要结构多为β(1→6)和β(1→3)糖苷键。菌株70810来源于泡菜,安全性好,所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,且可不经纯化直接利用,在食品与乳品加工等方面将具有很好的应用前景。     

响应面法优化β-半乳糖苷酶法制备低聚半乳糖工艺

本文以乳糖为起始原料,在单因素实验的基础上,结合响应面分析法考察加酶量、反应温度、反应时间、反应pH等因素对低聚半乳糖总产率和低聚半乳四糖产率的影响,优化β-半乳糖苷酶法制备低聚半乳糖工艺。结果表明,β-半乳糖苷酶法制备低聚半乳糖的最佳工艺参数为起始乳糖浓度300 g/L、加酶量8.25 U/g乳糖、反应温度49 ℃、反应时间16 h、反应pH5.6。在此条件下,低聚半乳糖总产率为14.61%,低聚半乳四糖产率为3.31%。该方法针对性提高高聚合度低聚半乳糖的产率,可为低聚半乳糖的功能性应用及特医食品的研发提供参考。     

植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖的工艺优化

以乳糖为底物,利用含β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖(GOS).在5L发酵罐上进行了以乳糖为碳源的植物乳杆菌WZ011的厌氧培养,β-半乳糖苷酶产量在发酵14 h时达到最大值5 U/mL.收获的植物乳杆菌菌体用于透性化全细胞催化生产GOS的研究.比较了乙醇、Tween 80、SDS、DMSO、丙酮这五种渗透剂对胞内β-半乳糖苷酶酶活的影响.结果表明以40％乙醇作为渗透剂处理最为有效,β-半乳糖苷酶胞内酶活可达500 U/g(细胞干重DCW).进一步对40％乙醇渗透处理后整细胞催化生产GOS的工艺条件进行了研究,结果表明乳糖浓度、初始pH、温度和反应时间对GOS合成均有显著影响.在乳糖质量浓度为400g/L,初始pH为7.0,温度50℃及反应进行10h的条件下,GOS产量达到最大值32％(质量分数).     

Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

低聚半乳糖具有促进肠道有益菌增殖、抗龋齿、低能量等特定的生理功能。研究了酶反应条件对脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响。以乳糖为底物,k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,反应20h低聚半乳糖的产率达到最大。底物初始浓度影响k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的产率,乳糖起始浓度由110mg/mL增加到660mg/mL,低聚半乳糖的含量从43mg/mL增加到207mg/mL。     

环氧基载体固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

采用悬浮聚合法制备了表面含有活性环氧基的载体,研究了初始酶浓度及反应时间对该载体固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶效率的影响,应用环氧基载体固定化酶催化合成低聚半乳糖,探讨影响低聚半乳糖合成量的因素.结果表明:制备的环氧基载体为单一分散、近似球形、粒径约为150～200μm的球体.初始酶浓度为4.0mg/m L,环氧基载体对K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶的固定化量达到最大值,为69.8mg/g载体,初始酶浓度为3.0mg/m L时,固定化酶的活力回收率最大,约为70％.固定化的酶量随着固定化的时间增加而增加,固定化10h时酶量达到最大值.固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适底物浓度为150g/L,反应4h GOS的产率达到最大,为40g/L.     

重组β-半乳糖苷酶的制备及转化条件优化

以前期构建的产Bacilluscirculansβ-半乳糖苷酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-lac为菌种,进行摇瓶发酵诱导培养,培养24 h胞外上清酶活达15 U/mL。利用制备的β-半乳糖苷酶粗酶液进行酶转化实验。优化了酶转化条件,考查了初始pH、反应温度、乳糖质量浓度、加酶量和反应时间等因素对低聚半乳糖产率的影响。确定最优转化条件为:初始pH 6.5、反应温度55℃,起始乳糖质量浓度为700 g/L,加酶量为8 U/mL。在此条件下反应16 h,低聚半乳糖转化率可达57%。     

乳酸克鲁维酵母乳糖酶合成低聚半乳糖的研究

低聚半乳糖因其具有优越的生理功能而获得广泛关注。利用乳酸克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶水解乳糖进行酶法合成低聚半乳糖的研究,应用薄层层析定性、HPLC-ELSD定量技术对低聚半乳糖进行分析,并对其合成条件进行优化。β-半乳糖苷酶水解乳糖合成低聚半乳糖的最佳反应条件为:底物(乳糖)浓度50%、加酶量40 U/g、p H7.5、50℃,以上条件下反应2 h,低聚半乳糖产率为23.4%。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

双醛氧化纤维素固定化β-半乳糖苷酶

以双醛氧化纤维素为载体固定化β-半乳糖苷酶,研究了固定化酶的制备条件、微观结构及酶学性质,结果表明:固定化时间为4 h,[酶]/[载体]=1:15(g:g)时,固定化酶的活力最高为0.517 U/g。红外光谱和扫描电镜对固定化酶的微观结构研究表明,双醛氧化纤维素的醛基与β-半乳糖苷酶的氨基发生共价反应形成固定化酶。与游离酶相比,β-半乳糖苷酶经过固定化后热稳定性和耐酸碱性增强,米式方程分析表明,β-半乳糖苷酶经固定化后与底物的亲和力降低,固定化酶重复使用5次后,相对酶活力为63%。     

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的：本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides,GOS）提供基础。方法：从多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶（PpBgal42A）基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果：PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适p H和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0～9.5范围内和4～35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31...     

基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究

研究了反应时间、乳糖浓度、温度、加酶量、pH对低聚半乳糖合成的影响,结果表明,加酶量、乳糖浓度、反应温度的影响较大。通过正交实验确定的米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳工艺条件为:pH6.0、温度55℃、乳糖浓度40%、加酶量40U/g、反应时间32h。在最佳工艺条件下,低聚半乳糖的合成率为32.4%。     

产β-D-半乳糖苷酶马克斯克鲁维酵母的分离鉴定及其产酶特性

从藏灵菇中分离筛选到的一株高产β-D-半乳糖苷酶菌株ZX-5,经ITS DNA序列分析,鉴定为马克斯克鲁维酵母。对产酶培养基的最佳碳源和氮源优化结果为半乳糖2.0%,胰蛋白胨1.0%;产酶优化条件:温度30℃,培养基初始pH 6.5,装液量30%,转速100 r/min,接种量2.0%,发酵36 h。粗酶液酶活力为2.60 U/mL;经硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析,获得纯化酶的比活力为157.35 U/mg。酶最适反应温度35℃,最适pH 6.0,在20~40℃和pH 5.0~7.0的范围内酶的稳定性较好;Mn2+对酶的活性有促进作用。利用菌株ZX-5β-D-半乳糖苷酶分解乳糖并合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS),在35℃、乳糖质量浓度60 g/100 mL、酶浓度1.0 U/mL条件下,乳糖水解率达68.34%(50 h),GOS产率达34.70%(40 h),具有潜在的应用前景。     

β-环糊精与α-半乳糖苷酶相互作用的研究

通过单因素试验和正交试验,以相对酶活作为考察指标,研究β-环糊精与α-半乳糖苷酶之间的相互作用。结果表明,不同条件下β-环糊精对α-半乳糖苷酶有不同程度的抑制作用,并且得出了最具抑制效果的反应参数,即在反应体系中,β-环糊精浓度为10 mmol/L,反应时间为90 min,温度为35℃,pH为6.5时β-环糊精对α-半乳糖苷酶的抑制作用最明显,此时相对酶活为19%。     

双歧杆菌和乳酸菌β-半乳糖苷酶转糖基作用的研究进展

双歧杆菌和乳酸菌作为一般认为安全的微生物,是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal）的较好来源。部分双歧杆菌和乳酸菌菌株能够产生具有转糖基活力的β-gal,以乳糖为底物可合成具有益生作用的低聚半乳糖（galactooligosaccharides,GOS）,而GOS产物的产量和组成受到β-gal的来源以及反应条件的影响。因此,本文总结了能够产生具有转糖基活力的β-gal的双歧杆菌和乳酸菌菌株,比较了两类来源的β-gal的酶学性质,并重点阐述了这两类β-gal在GOS合成中的应用。     

微泡菌ALW1重组β-半乳糖苷酶的异源表达和酶学性质

β-半乳糖苷酶催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是乳制品加工中重要的酶。该研究将微泡菌ALW1菌株的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达和纯化,研究其酶学性质。结果表明,微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶属于GH1家族,利用Ni-NTA Agarose亲和层析获得的重组β-半乳糖苷酶分子量约为64 ku。重组酶的最适反应温度为30 ℃,最适pH为4.5。温度低于25 ℃、pH 4.0~5.0条件下,β-半乳糖苷酶具有良好稳定性。重组β-半乳糖苷酶对DTT、吐温20和吐温80具有良好的耐受性;离子型去垢剂SDS和CTAB存在时,β-半乳糖苷酶几乎丧失活性。重组β-半乳糖苷酶的Km和Vmax分别为10.98 mmol/L和7.48 U/mg。结构模拟显示,微泡菌β-半乳糖苷酶的催化酸/碱残基和亲核残基分别为Glu186和Glu370。该研究为来自微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶在食品领域的应用奠定理论基础。     

Bacillus circulans来源β-半乳糖苷酶在Bacillus subtilis中的表达、性质及发酵优化

低聚半乳糖(galactooligosaccharide, GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖,因其优良的益生功能以及在高温和低pH下较高的稳定性而被广泛应用于婴幼儿奶粉等食品中,其主要由β-半乳糖苷酶以乳糖为底物进行生产。为了将具有更高转化率的β-半乳糖苷酶应用于食品领域,该研究首次将Bacillus circulans来源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ在Bacillus subtilis中进行了异源表达,并对其酶学性质、GOS的制备进行了测定,同时为了降低其工业化应用成本,对重组菌在摇瓶及3-L罐的发酵条件进行了优化。结果表明,重组β-Gal-Ⅱ制备GOS的最适作用条件为50℃、pH 5.0,该条件下GOS转化率在8 h可达最高值60.32%;在摇瓶的发酵条件优化中,以安琪酵母粉和玉米浆干粉各7.5 g/L为复合氮源时,总酶活力最高,可达6.82 U/mL,是TB发酵的1.5倍,单一氮源发酵的2～2.5倍;在3-L罐上进行了33、37℃两个温度的发酵优化,37℃发酵产量优于33℃,最终总酶活力可达138.3 U/mL,是摇瓶发酵的20.3倍。该研究为GOS的工业化生产提供技术...