生物素对L-缬氨酸发酵的影响

为研究生物素添加量对谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamate）发酵生产L-缬氨酸的影响,以谷氨酸棒状杆菌XV0505（Leu－＋Ile－＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）为供试菌株,考察不同生物素添加量条件下菌体量、耗糖、产酸以及副产物L-丙氨酸的情况,确定了生物素最适添加量为50 μg/L;利用膜偶联透析发酵方式有效解除了发酵生产过程中产生的反馈抑制现象,降低了副产物的产量,提高了L-缬氨酸的转化率及产量。与原单批次发酵的工艺相比,新工艺的最终L-缬氨酸总量达到106.1 g/L,产量提高了47.4%,糖酸转化率提高到34.5%。     

谷氨酸棒状杆菌合成L-高丝氨酸的代谢改造与发酵条件探究

目的:本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞,构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法:首先通过外源添加0～40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性;随后,通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径,获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1;在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果:与大肠杆菌相比,谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1,发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后,该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L,较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论:通过阻断L-苏氨酸的合成,成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1,并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段,为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。     

基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造（英文）

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C.glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C.glutamicum YILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量(分别从1.32μmol/g(细胞干质量,下同)和5.18 g/L提高至3.32μmol/g和5.81 g/L),但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilv BNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brn E和brn F,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C.glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilv BNC操纵子及brn E和brn F能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

双底物指数流加和双阶段溶氧控制对谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的影响

为了实现L-异亮氨酸的高效生产,提高谷氨酸棒状杆菌YILW生产L-异亮氨酸的产量和生产强度,在详尽分析磷酸盐和玉米浆初始浓度对L-异亮氨酸发酵影响的基础上采用了双底物(玉米浆、磷酸盐)指数流加与双阶段溶氧相结合的控制策略进行L-异亮氨酸发酵。结果表明,最佳磷酸盐和玉米浆浓度分别为1.5 g/L和35 mL/L,此条件下分批补料发酵菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为27.66 g/L和25.89 g/L。在生长阶段进行双底物指数流加并结合双阶段溶氧控制,发酵60 h菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为32.29 g/L和31.32g/L,较优化前分别提高16.73%和20.97%。     

有机氮源对谷氨酸棒杆菌发酵L-缬氨酸的影响

以L-缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌XV0505为供试菌株,研究有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响,确定了玉米浆代替豆饼水解液作为有机氮源的发酵工艺,降低了发酵成本;考察不同玉米浆浓度对谷氨酸棒杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸过程中生物量、耗糖速率、L-缬氨酸产量、副产物积累及氨消耗等方面影响,确定了玉米浆的适宜添加浓度;考察了玉米浆与生物素不同配比对L-缬氨酸分批发酵过程的影响,确定了最适生物素添加浓度。与原工艺相比,新工艺的菌体生物量及产酸提高了13.2%和18.5%。     

氯化胆碱对L-缬氨酸发酵的影响

为探究氯化胆碱在微生物菌体培养方面的作用,采用微生物发酵法生产L-缬氨酸,以谷氨酸棒状杆菌XV0505(Leu~-+Ile~-+2-TA~r+α-AB~r+SG~r)为供试菌株,探究了其在不同氯化胆碱添加量以及在底物添加与联合随糖流加2种添加方式下生长、耗糖、产酸的情况。结果表明,发酵过程中氯化胆碱的添加方式为底物添加联合随糖流加,底物中氯化胆碱最适添加浓度为0. 5 g/L。此方式下,发酵周期内产酸量增加了18 g/L,较未添加氯化胆碱批次提升了26. 4%。氯化胆碱的外源添加能够有效增强菌体的活力,加快菌体生长,提高菌体产酸速率,为L-缬氨酸的生产提供了参考。     

缬氨酸生产菌株的定向改造及发酵优化

缬氨酸是人体必需氨基酸之一,具有重要的生理生化作用。为进一步提高缬氨酸产量及优化发酵过程的温度控制,从谷氨酸棒杆菌细胞壁肽聚糖合成途径的2个关键基因murA(cgl0352)和murB(cgl0353)入手,从1株缬氨酸生产菌中敲除murA和murB基因构建出重组工程菌株C.glutamicum A301。摇瓶发酵结果显示,该菌株具有温度敏感性,在变温发酵的条件下,能从生长型状态转化为产酸型状态,促进缬氨酸的积累。在5 L发酵罐中采用分段控温策略发酵,即前15 h控温33℃,15 h之后提温至39℃,重组工程菌株的缬氨酸产量达到35.5 g/L,与全程33℃发酵相比提高了55.7%。研究为缬氨酸发酵过程温度控制提供了经验,同时对于谷氨酸棒杆菌的定向改造提供了一种思路。     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

氮源及其补加策略对L-缬氨酸发酵的影响

通过分析黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的过程,得知在菌体生长期和快速产酸期氮源对L-缬氨酸发酵的影响不同。以黄色短杆菌XV0505为供试菌株,研究了不同氮源种类及不同氮源浓度对L-缬氨酸发酵过程的影响,选定了以豆饼水解液和硫酸铵为氮源,并确定了合适的初始氮源浓度。在初始氮源浓度相同的情况下,考察了间歇流加补氮策略、恒氮源浓度补氮策略和幂函数流加补氮策略对L-缬氨酸发酵的影响,研究发现,幂指数补氮策略可减少频繁的取样及铵浓度检测,在缺乏在线监测系统和反馈自控系统的情况下,将发酵体系中氮源浓度维持在合适值,既可适度促进菌体生长,又可使L-缬氨酸的产量得到进一步提高。在最优的氮源添加策略下,在30 L发酵罐发酵60 h,发酵液中L-缬氨酸可达63.17 g/L,糖酸转化率24.69%。     

L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。