沙门氏菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立

建立利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对食品中沙门氏菌的快速检测方法.从食品中分离出可疑沙门氏菌,利用不同培养基分离纯化,通过MAIDI-TDF-MS法进行鉴定,并与其他检测方法比较.MALDI-TOF-MS对野生沙门氏菌株的鉴定结果与传统鉴定结果一致,说明本试验建立的方法对于沙门氏菌的鉴...     

沙门氏菌MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱分析方法的研究

以沙门氏菌标准菌株(Salmonella enterica DSM 17058 T)为研究对象,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对其进行蛋白质指纹图谱分析,进而得到正确的鉴定结果。为了获得重现性良好的质谱图,对沙门氏菌的最佳培养基、最适培养时间以及样品前处理方法进行了优化,从而确立沙门氏菌MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱标准分析方法。结果表明:乙醇/甲酸处理法所得图谱中的特征峰多,包含更多的蛋白标志物,所得图谱基线平滑,噪音少,信噪比高,是最佳的样品处理方法。以营养丰富的哥伦比亚琼脂为培养基,在24 h时即可达到强峰值信号,质谱图重现性良好,鉴定结果准确,并且相比于其它3种培养基所需培养时间短。     

副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立与应用

目的:建立快速检测副溶血性弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测方法。方法:考察培养基、培养时间、培养温度以及样品前处理方法对图谱质量和鉴定结果的影响,对方法的稳定性、重复性进行研究;采集461株副溶血性弧菌食品分离株MALDI-TOF-MS指纹图谱,并对图谱进行分析。结果:采用2%NaCl-TSA培养基,在37℃,24 h条件下培养,可达到强峰值信号,谱图重现性良好,甲酸-乙腈提取法获得的质谱图特征峰多,信噪比高;461株副溶血性弧菌食品分离株有97.6%的菌株鉴定分值大于2.000。结论:本研究建立的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS鉴定方法结果准确,可用于实际检测。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与VITEK和rpoB基因测序三种方法对食品中葡萄球菌鉴定效果的比较

目的 比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF MS)、rpoB基因测序和VITEK 2 Compact三种方法对葡萄球菌的鉴定效果.方法 同时采用三种...     

基于MALDI-TOF-MS技术筛选及鉴定大曲中芽孢杆菌

该研究对基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）技术体系进行改进与优化,创新性地引入浓香型大曲中芽孢杆菌（Bacillus）的筛选及鉴定,并结合分子生物学技术对该技术鉴定结果进行验证。结果表明,采用传统微生物培养分离法从大曲中分离得到126株菌株,其中125株通过MALDI-TOF-MS技术筛选鉴定获得9.0以上可信度分值,其中目标菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的鉴定结果与分子生物学鉴定结果一致,说明该技术历经5～6 d可以准确地完成大曲样品中目标菌株的筛选鉴定,比传统微生物筛选鉴定方法至少节约1～2周时间。因此,基于MALDI-TOF-MS技术参与复杂样品中目标菌株的筛选与鉴定是一条高效的、可行的路径。     

MALDI-TOF-MS对金桔表面肠杆菌科微生物分布的研究

为了评估金桔的食用风险,试验采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)调查金桔表面肠杆菌科微生物分布情况,筛选致病微生物,同时采用与生化鉴定和16S rDNA测序鉴定辅助鉴定结果。实验共分离6种的肠杆菌科细菌,分别为日沟维肠杆菌、分散泛菌、肺炎克雷伯菌、阪崎肠杆菌、生癌肠杆菌、阴沟肠杆菌,其中分散泛菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌出现频率较高;对三种鉴定方法进行比较分析,MALDI-TOF-MS鉴定结果与另外两种与属水平一致,种水平有偏离;MALDI-TOF-MS对分离微生物进行聚类分析表明同属微生物亲缘较近,同种微生物峰谱图仍有差异。试验结果表明,金桔表面具有肠道致病微生物,有一定食用风险,建议加强农产品致病菌常规的检测及风险评估力度;MALDI-TOF-MS方法可分辨率高且能提供基于蛋白质水平归类分析可以用于农产品微生物的快速检测。     

克罗诺杆菌属食品分离株种水平鉴定方法比较研究

目的研究食品中分离克罗诺杆菌属种的鉴定方法,旨在建立稳定、可靠的种的鉴定方法。方法本研究选择三种鉴定方法,包括生化鉴定(VITEK 2 Compact)法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、全基因组测序,通过比较分析三种方法对19株克罗诺杆菌属的鉴定结果,阐述三种鉴定方法的优缺点及其适用性。结果本研究中19株克罗诺杆菌属的鉴定结果显示,VITEK 2 Compact对阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌的鉴定准确率只有67%和66%,而MALDI-TOF MS和全基因组测序的鉴定结果一致,因此可以判定MALDI-TOF MS能够快速、准确、高通量对克罗诺杆菌属进行种的鉴定。但是MALDI-TOF MS受限于数据库,不能鉴定到亚种的水平。结论本研究结果提示VITEK 2 Compact法不适用于克罗诺杆菌属种的鉴定;全基因组测序鉴定结果准确可靠;MALDI-TOF MS可以实现快速、高通量、准确的鉴定,仍需要进一步研究克罗诺杆菌属3个亚种的蛋白指纹图谱特点,丰富蛋白指纹图谱数据库,使其能够准确鉴定克罗诺杆菌属的7个种和3个亚种。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定食品中金黄色葡萄球菌

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对食源性金黄色葡萄球菌的鉴定效果。方法应用MALDI-TOF MS对210株食源性金黄色葡萄球菌进行鉴定,与传统的生化鉴定结果进行比较,并用SPSS19.0软件分析鉴定结果。结果 MALDI-TOF MS将210株金黄色葡萄球菌鉴定到种、属水平分别为98.10%和1.43%,与VITEK 2鉴定方法无差异(P0.05)。结论 MALDI-TOF MS具有简便、快速、准确等优点,适用于对食源性金黄色葡萄球菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱定性分析啤酒中糖类条件的优化

通过选择不同基质(2,5-二羟基苯甲酸、super DHB、2,4,6-三羟基苯乙酮)和设置不同啤酒样品稀释倍数(从原液到1 000倍稀释),优化了MALDI TOF MS定性分析啤酒中糖类的试验条件。研究结果显示,3种基质中,2,4,6-三羟基苯乙酮应用于MALDI TOF MS对啤酒中糖类表征的能力优于另外两种基质。当以2,4,6-三羟基苯乙酮为基质,啤酒样品稀释10倍时,MALDI TOF MS可达良好的定性分析效果。     

基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的鉴定

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌广泛存在于食品及环境中,对食品安全造成一定的威胁。在食源性致病菌检测过程中,选择合适的方法不仅可以缩短时间,节省人力物力,还能更好地溯源。选取210株沙门氏菌和18株金黄色葡萄球菌,使用16S rDNA序列测定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK全自动细菌鉴定系统对其鉴定,使用R软件包(v3.6.1)对鉴定结果进行统计和相关性分析,比较3种方法的鉴定水平和效率。结果表明:3种方法均可将210株沙门氏菌(100.0%)鉴定到属水平;16S rDNA序列测定方法可将18株(100.0%)金黄色葡萄球菌鉴定到属水平,可将其中15株(83.3%)菌鉴定到种水平;MALDI-TOF-MS和VITEK可将18株金黄色葡萄球菌(100.0%)鉴定到种水平。除16S rDNA序列测定方法外,其余2种方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的鉴定水平相同,而MALDI-TOF-MS鉴定所需时间最短、效率最高。     

单增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鉴定与分型研究

为建立单增李斯特氏菌的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)快速鉴定与分型方法,实验收集37株单增李斯特氏菌分离株,应用MALDI-TOF-MS采集图谱,获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,建立单增李斯特氏菌鉴定数据库。采用单增李斯特氏菌标准菌株进行验证,表明鉴定结果的可信度很高。在数据库信息的基础上,对37株单增李斯特氏菌分离株进行聚类分型。分型结果表明,在蛋白质水平上,MALDI-TOF-MS可把37株单增李斯特氏菌分成9个型别。     

多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3种食源性致病菌

建立可同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。根据单增李斯特菌inl A基因、鼠伤寒沙门氏菌inv A基因、大肠杆菌O157:H7的wzy基因设计3对特异性引物。对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、d NTP浓度进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件。结果表明:25μL反应体系,10×PCR buffer为2.5μL,Mg Cl2(25 mmol/L)为3.5μL,d NTPs(2.5 mmol/L)为2μL,inl A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,inv A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,wzy基因上下游引物(5μmol/L)为2μL,单增李斯特菌DNA模板为1μL,鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1μL,大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1μL,ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)为0.3μL,加dd H2O补足25μL。反应条件为95℃预变性3 min;94℃变性30 s,53.9℃退火30 s,72℃延伸30 s,32个循环;72℃延伸10 min。鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g,大肠杆菌O157:H7 3.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。该技术可为快速检测鲜切哈密瓜中病原菌污染度及其控制提供参考依据。     

甜樱桃采后腐烂病原菌的分离与鉴定

为了研究山西省甜樱桃果实采后贮藏过程中的病原菌,本文对低温贮藏过程中发生腐烂的甜樱桃果实的病原菌进行分离纯化。在形态学基础上,结合基因序列分析,对分离获得的2株病原真菌YTA、YTB进行鉴定。YTA和YTB利用真菌通用引物ITS序列进行PCR扩增,将测序所得的基因序列与NCBI的GenBank进行同源序列比对,确定甜樱桃病原菌的生物学分类。结果表明:病原菌YTA为草酸青霉(Penicillium oxalicum),YTB为葡萄孢属(Botrytis sp.),将其重新回接到甜樱桃上,均能引起甜樱桃腐烂。草酸青霉(Penicillium oxalicum),葡萄孢属(Botrytis sp.)均是造成山西省甜樱桃采后腐烂的病原菌。     

基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用

建立在DNA杂交基础上的基因探针技术是现代分子生物学中的一种常规技术。用基因探针技术检测食品中的有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。近年来 ,有关非放射性基因探针、DNA生物传感器探针及分子信标探针等技术研究取得的重要进展 ,必将加速基因探针技术在食品微生物检测中的应用。本文对多种基因探针的技术原理与研究应用概况及最新进展进行了综述讨论     

肉中4种致病菌的PCR快速检测方法的建立

目的:建立一种能同时检测肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单核增生李斯特菌的多重PCR检测方法。方法:根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵袭蛋白基因(invA)、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原基因(ipaH)和单核细胞增生性李斯特菌的内化素基因(inlA)设计引物,通过优化好的反应体系进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因。结果:特异性实验结果表明4种菌均能在相应位置扩增出特异性条带。对污染4种菌的猪肉进行检测,确定出金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检出限是102CFU/mL,志贺氏菌和单核增生李斯特菌的检出限是101CFU/mL。结论:本实验建立的多重PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏,适用于肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门菌和单核增生李斯特菌的快速检测。     

多重PCR技术在食源性病原细菌检测中的应用

食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一,快速检测食品中病原细菌是及时有效预防病原细菌传播及食物中毒的重要前提。多重PCR作为一种可同时检测多种病原细菌的方法应用日益广泛。本文介绍了多重PCR技术在食源性病原细菌检测中的应用现状及其多重PCR反应条件的优化,同时提出了存在的问题并对应用前景作了展望。