双酶偶联催化马来酸生成L-天冬氨酸

L-天冬氨酸作为一种大宗氨基酸产品,在食品、医药和化工等方面有着广泛的用途。该研究在删除了富马酸水合酶基因(fumAC)的E.coli BL21(DE3)中,构建了6种不同的马来酸顺反异构酶基因(mai A)与L-天冬氨酸裂解酶基因(aspA)双酶偶联的表达体系,通过比较其共表达效果和催化效率,获得最佳的偶联体系E.coli BL21(DE3)ΔfumAC/pRSF_(Duet-1)-mai A-aspA。该菌株能够在细胞浓度OD_(600)值为8的催化体系下,在390 min内将3.2 mol/L的马来酸完全转化为L-天冬氨酸铵,其浓度达到3.14 mol/L,中间产物富马酸几乎没有积累,转化率达到98%以上。此外,为解决在高浓度的黏稠反应液中细胞回收利用困难的问题,对重组工程菌进行细胞固定化,固定化细胞回收利用8次之后,其相对酶活还剩下81%,显著提高了细胞的利用率,降低了L-天冬氨酸生产成本,为其工业化生产奠定了基础。     

粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。     

两种不同来源富马酸酶酶学性质比较

目前L-苹果酸已经工业化生产,但仍存在苹果酸产生菌株来源有限和产量不高等问题,为了拓展苹果酸产生菌的种类及酶活性,通过基因工程手段分别利用pETDuet-1为载体在宿主细胞Escherichia coli BL21 (DE3)中重组表达了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(E.coli)来源的富马酸酶,并对两者的酶学性质以及催化效率进行了比较.结果表明:两种来源的富马酸酶均构建成功,谷氨酸棒状杆菌来源的富马酸酶(fumCc)最适温度和pH分别为30℃和8.0,大肠杆菌来源的富马酸酶(fumCe)最适温度和pH分别为40℃和7.0;酶动力学分析表明,fumCc酶催化效率(Kcat/Km)是fumCe的3.8倍.0.1g菌体细胞在10 mL转化体系中催化1.5 g富马酸钠,在各自的最适条件下反应6h,L-苹果酸的产率分别为85％和34％.     

D-来苏糖异构酶的酶学性质研究

为探索D-甘露糖的高效酶法合成途径,作者克隆了来源于Peptococcaceae bacterium 1109的D-来苏糖异构酶基因,将其导入到E. coli BL21(DE3)中进行表达。该酶的最适底物为D-来苏糖,并可以高效催化D-果糖与D-甘露糖之间的差向异构反应。以D-果糖为底物时,重组表达的D-来苏糖异构酶的比酶活可达2.5 U/mg,该酶的最适pH为7.5,最适温度为70℃,Co~(2+)可以显著提高该酶的活力。在最适条件下以500 g/L的果糖为底物,反应8 h达到平衡,平衡转化率达19.17%,生产D-甘露糖95.85 g/L。     

嗜热栖热菌海藻糖合酶的分子改造及其应用

对前期获得的Thermus thermophilus海藻糖合酶进行了分子改造以提升其催化制备海藻糖的性能。利用定点突变技术,将第251位Pro突变为Leu,得到突变体P251L,并于E.coli BL21(DE3)中重组表达,重组菌在摇瓶中发酵酶活为6.9 U/m L。以突变体催化制备海藻糖的研究表明,当以0.3 g/m L麦芽糖为底物,初始反应p H为7.5,温度为50℃,加酶量为20 U/g麦芽糖时,转化率达到最高值62.0%,比天然酶高出13.0%。     

磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用。以大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子量,并对培养条件进行优化,进一步探究重组菌的酶学性质。在有机相-水相双相反应体系中进行PS的制备,并对制备工艺进行系统优化。成功构建了重组菌株E. coli BL21 (DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子质量约为60 k Da。重组菌通过诱导条件优化,酶活最高可达38. 58 U/m L,是优化前的2. 26倍。PLD粗酶液的最适p H值为7. 5,最适反应温度为60℃。制备工艺优化结果表明40℃条件下,在8 m L的乙酸乙酯中溶解64 mg的卵磷脂,在4 m L酶液中溶解160 mg的L-丝氨酸,得到的PS转化率最高,可达28%,产量为1. 34 g/L。该PLD粗酶液催化性能良好,为酶法制备磷脂酰丝氨酸奠定了基础。     

苯乙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达及静息细胞生物转化乙基香兰素的研究

对恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida ATCC12633)中的苯乙酮酸脱羧酶基因mdlC进行克隆,导入质粒载体pET28a中,将构建得到的重组质粒pET28a-mdlC转化于宿主细胞E.coliBL21(DE3),重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-mdlC)经IPTG诱导,SDS-PAGE分析得到相对分子质量约为57 000的蛋白质条带。将E.coli BL21(DE3)(pET28a-mdlC)和E.coli BL21(DE3)(pET30a-mdlB)两株重组菌以混合静息细胞的形式作为生物催化剂,利用各自胞内的重组酶对3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸(乙基扁桃酸)脱氢氧化、脱羧合成乙基香兰素。未经优化,催化24 h后反应液中乙基香兰素的质量浓度可达1.94 g/L,且没有副产物产生。同时研究表明,该混合静息细胞重复使用3次能保持90%以上的催化活力,还有效缩短了反应时间。     

生物转化法应用重组谷氨酰转肽酶合成L-茶氨酸

构建了一个高效表达大肠杆菌来源的GGT重组质粒pET28a-GGT并转化E.coli BL21 (DE3),工程菌株经0.2mmol/L IPTG,20℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到1.5U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的26倍.工程菌粗酶液以267mmol/L L-谷氨酰胺和2.0mol/L乙胺作底物,37℃、pH10.0条件下反应4h,L-茶氨酸的生成量达到26.9g/L,L-谷氨酰胺的转化率为57.8%.     

不同来源S-腺苷甲硫氨酸合酶在大肠杆菌中的表达及催化应用

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum基因组为模板扩增出SAM合酶编码基因BcmetK和CgmetK,以pETDueT1质粒为载体,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为底盘细胞,构建了SAM合成菌株E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK和E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK。其次,针对SAM合成菌株全细胞催化合成体系条件进行了优化,重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度50 mmol/L、1.2%(体积分数)的OD₆₀₀值约9.0的细胞悬浮液、600 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO₄、100 mmol/L...     

固定化马来酸顺反异构酶合成富马酸

为了制备稳定高效的固定化酶转化底物马来酸来生产富马酸,本文将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶与R5肽段融合表达,融合酶比酶活可达42 U/mg。将细胞破碎上清液用40%硫酸铵沉淀,再用终体积分数为0.1%的戊二醛在室温下交联1 h形成交联酶聚集体,最后用1 mol/L正硅酸甲酯包埋,固定化酶的酶活回收率达到60%。在55℃下,固定化酶的半衰期可达4 h(游离酶仅为0.5 h),进行8次重复催化反应后,可保留78%的初始酶活。将固定化马来酸顺反异构酶装入填充床反应器,连续转化10个批次后富马酸的转化率可保持在95%以上。该研究为马来酸顺反异构酶生产富马酸的工业化应用提供了借鉴。