烟草白粉病抗性连锁分子标记开发及育种利用

  目的  提高烟草白粉病抗病育种效率,有效防止抗性丢失。  方法  通过烟草种质资源白粉病抗性鉴定获得抗源材料,利用F2和BCF1分离群体进行白粉病抗性遗传规律和分子标记连锁分析,开发与烟草白粉病抗性紧密连锁的分子标记。  结果  获得白粉病抗源材料2份,分别为台烟7号和KE1,其中台烟7号的白粉病抗性符合双基因隐性遗传规律。根据抗感亲本的NtMLO基因的差异开发了分子标记,利用分离群体证明该标记与白粉病抗性共分离,并应用于主栽品种的抗性回交改良。  结论  开发了与烟草Ntmlo白粉病抗性共分离的分子标记,可显著提高烟草白粉病抗病育种效率。      

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

湖北晒晾烟地方种质对烟草白粉病抗性的温室鉴定

为了明确湖北晒晾烟地方种质对烟草白粉病的抗性,利用中国农业科学院烟草研究所保存的白粉病菌,在温室中采用人工喷雾接种方法对湖北的88份地方晒晾烟种质进行了鉴定。结果表明:不同晒晾烟种质对烟草白粉病的抗病性差异明显,88份种质材料中高抗13份,中抗39份,中感和高感均为18份。抗性最高的种质为LC04,ZX06和WF04,其相对抗病指数为0.99;抗性最差的FJY01和CY08,其相对抗病指数不足0.1。对不同抗病类型种质的抗病性差异显著性分析显示,不同抗病类型种质的病叶率、病情指数和相对病情指数均达到显著水平。利用DPS数据分析软件对88份种质进行聚类分析显示,在种质抗性反应谱系图上划分为高抗、中抗、中感和高感4类。     

云南烟草品种资源炭疽病抗性测定

对45个云南地方烟草品种在温室进行人工接种炭疽病菌,测定了品种的抗性。结果表明,山峒烟、象耳朵烟等5个品种表现为高抗;马关辣烟等3个品种表现为抗病;马烟、枇杷烟、窝笋烟等15个品种为中抗;软叶子草烟、大毛耳烟等15个品种感病;龙骨烟、麻粟坡晾烟等7个品种为高度感病。     

生防菌株LB-1对烟草白粉病的抑制效果及对病菌孢子萌发的影响

  目的  为检测近缘毛壳菌（Chaetomium subaffine）LB-1对烟草白粉病的抑制效果。  方法  以中烟90为供试烟草品种,分析了LB-1对烟草白粉病的抑制效果及对病菌分生孢子萌发的影响。  结果  LB-1菌悬液叶面处理对供试烟草盆栽苗和离体叶段白粉病的发生无明显影响,但LB-1发酵液叶面喷施盆栽苗和浸蘸处理离体叶段均能显著抑制烟草白粉病的发生,防效和抑制率分别为44.90%和53.11%;显微镜检发现,LB-1发酵液能够引起白粉病菌孢子的皱缩和畸形。  结论  近缘毛壳菌株LB-1可用于防治烟草白粉病。      

洛阳烟区烟草白粉病病原鉴定及寄主调查

为明确洛阳烟区烟草白粉病的病原菌及其寄主植物种类,通过形态学观察和分子生物学方法鉴定了从洛阳烟区采集的烟草白粉病样品的病原菌,并采用致病性测定与分子生物学分析相结合的方法,检测其在洛阳烟区的寄主范围。结果表明：(1)洛阳烟区烟草白粉病病原菌为烟草高氏白粉菌（Golovinomyces tabaci）;(2)除烟草外,采集的烟田周边22种感染白粉病植物的病原菌均不为烟草高氏白粉菌（G. tabaci）且这些病原菌对烟草均不具有致病性;(3)采集的烟草白粉病样品的病原菌对烟田周边22种健康植物中车前草和豌豆具有致病性,分子生物学鉴定结果进一步证实了车前草和豌豆为洛阳烟区烟草白粉病病原菌的寄主植物。     

烟草品种对镰刀菌根腐病的抗性鉴定

采用盆栽烟株带菌麦粒接种法测定12个烟草品种（系）对烟草镰刀菌根腐病的苗期抗病性,结果表明,中烟98、贵烟6号、云烟87、7478、NC89和豫烟13号对镰刀菌具有较高抗性,KRK26、中烟100和中烟205中等抗病,小黄金1025、豫烟10号和长脖黄对镰刀菌易感,在所有测试样品中,长脖黄抗性最低。长脖黄、小黄金1025和豫烟10号可作为对镰刀菌根腐病检测预警材料及镰刀菌根腐病的感病对照样品应用于相关研究中。      

不同烟草品种接种蚜虫后NtCPI1基因表达分析

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）与植物抗病抗虫性密切相关,为了明确烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因NtCPI1功能,研究其与烟草品种抗虫性的关系,对不同蚜虫抗性烟草品种进行了接虫前后NtCPI1荧光定量表达分析。结果表明,抗蚜烟草品种接种蚜虫后,NtCPI1表达量显著增加,664-01接种蚜虫3 h后,NtCPI1表达量为对照的10.8倍,Blue River接种蚜虫6 h后,NtCPI1表达量为对照的6.28倍;而螺丝头2474、云烟97和中烟100等感蚜品种接虫后,NtCPI1表达量极显著降低。NtCPI1可以作为高效抗蚜候选基因,具有潜在的应用价值。     

南方根结线虫1号小种对烟草抗病品种致病性变异研究

分别循环接种南方根结线虫1号小种虫卵于抗病烟草品种中烟14和感病烟草品种红花大金元幼苗,以探索该线虫对抗性烟草品种的致病性变异情况.结果显示,随着南方根结线虫1号小种繁殖世代的增加,其对中烟14的致病能力逐渐增强,连续繁殖5代后致病力差异显著,而该线虫对红花大金元的致病力变化不明显,表明南方根结线虫1号小种与其抗病品种连续互作可以导致其致病性增强.     

烟草PVY隐性抗病基因的分子标记及其适用性

马铃薯Y 病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草的重要病害, 种植抗病品种是经济有效的防治措施。分子标记辅助选择可提高抗病育种效率。来源于X-射线诱变的Virgin A Mutante(VAM) 的隐性抗PVY 基因位点(va)被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va 位点的育种利用效率, 根据烟草隐性抗PVY 基因(感病基因)eIF4E-1 基因序列, 设计特异扩增的引物CF2GR11,开发eIF4E-1 基因的分子标记, 并检测了该标记与抗性的遗传距离和在常见烟草资源中的适用性。CF2GR11 在云烟87、红花大金元和K326 等感PVY 品种可扩增出500 bp 产物, 在NC102、NC55 和K326PVY 等抗病品种无扩增条带。以抗、感PVY 亲本构建的101 个F₂ 单株为定位群体, 遗传连锁分析表明, CF2GR11 标记与烟草PVY 感病基因的遗传距离为0.99 cM。对46 份PVY 抗性明确的栽培烟草资源的检测表明, 供试资源的标记检测结果与抗性的吻合度为100%, 表明CF2GR11 标记适用性高。该目的基因标记可用于抗PVY 育种的辅助选择和抗PVY 资源的鉴定。      

烟草白粉病抗性基因型的多重PCR检测体系及其在回交育种中的应用

为提高烟草白粉病隐性抗病基因（感病基因）NtMLO1（M1）和NtMLO2（M2）在分子标记辅助选择育种中基因型的选择效率,根据已报道的M1和M2突变基因序列,设计4对单基因特异性引物,组成2个双重PCR反应体系,分别用于同时扩增M1和M2突变型或M1和M2野生型等位基因。结果表明,建立的2个双重PCR体系扩增的特异性片段与单重PCR体系扩增的片段完全吻合,突变基因纯合体只在突变基因多重PCR体系中产生191和306 bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生基因多重PCR体系中产生437和652 bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段。利用该体系可经过1次或2次PCR扩增准确检测出回交转育过程中回交或自交后代M1和M2的基因型,加快抗病品种育种进程。      

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

烟草野生种eIF4E1-S同源基因的多样性与马铃薯Y病毒抗性分析

[背景和目的]在栽培烟草中,真核生物翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4E1,eIF4E1-S)的缺失或突变能够抗马铃薯Y病毒(Potato virusy,PVY)侵染.为了解烟草野生种eIF4E1-S同源基因的多样性和PVY抗性状况,预测野生种含有抗PVY...     

五个烟草野火菌株的生理小种鉴定

  背景和目的  针对目前国内尚未以国际通行的抗性鉴别宿主区分烟草野火菌的生理小种, 首次基于抗性遗传规律鉴定了所收集野火菌株的生理小种归属。  方法  通过大田喷雾接种、温室浓度梯度接种、无损伤接种及同一叶片上的对比试验等4个平行试验, 将ATCC11528等5个野火菌株接种到黄花烟等6个不同抗源遗传背景的烟草上, 根据不同试验出现的不同病理反应对各野火菌株进行生理小种分类。  结果  所收集的5个野火菌株经多轮分子标签鉴定纯化, 可用于接种试验。野火菌株D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分别被鉴定为0、1、3等3个小种。  结论  采用国际通行的抗性鉴别宿主和4个平行接种试验区分了5个野火菌株的生理小种归属。为培育野火菌小种专化抗病烟草和克隆烟草中小种专化抗病基因提供了重要基础。      

烤烟不同成熟度上部叶中抗性淀粉与淀粉组分的变化及其与基因表达的关系

  目的  为研究烤烟上部叶在成熟后期及烘烤过程中淀粉组分和抗性淀粉含量的变化。  方法  以烤烟品种云烟87上部叶为试验材料,分析不同成熟度鲜烟叶及其在烘烤过程中淀粉组分和抗性淀粉含量的变化,阐明抗性淀粉和淀粉组分的相关性,通过实时定量PCR探究不同成熟度烟叶中淀粉合成相关基因的表达模式。  结果  （1）随烟叶不断成熟,淀粉粒数量迅速变多、体积增大,烟叶变黄时,叶绿体开始解体,淀粉粒逐渐降解。（2）不同成熟度鲜烟叶中直链淀粉含量与支链淀粉含量:欠熟 > 适熟 > 过熟,而抗性淀粉含量差异不大;在烟叶衰老过程中,支链淀粉迅速降解,而直链淀粉和抗性淀粉缓慢降解。（3）在烘烤过程中,淀粉降解主要集中在变黄期。烘烤结束后,烤烟中未降解的淀粉约50%为抗性淀粉。（4）淀粉合成基因葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶小亚基3（AGPS3）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶大亚基（AGPL）、颗粒结合型淀粉合酶（GBSS）、可溶性淀粉合酶2（SS2）、1, 4-a-葡聚糖分支酶（SBE1）、2, 3淀粉分支酶2（SBE2）和异淀粉酶2（ISA2）在欠熟烟叶中的基因表达水平较高,随烟叶衰老表达水平下调,而异淀粉酶3（ISA3）的基因表达水平在烟叶衰老过程中持续上调。  结论  烤烟不同成熟度上部叶中存在抗性淀粉,烘烤过程的变黄期是烟叶内淀粉降解的主要时期,但大田期形成的抗性淀粉很难在烘烤过程中充分降解。因此,可以通过适当推迟烟叶采收,降低烤烟淀粉含量,从而提高上部叶可用性。      

烟草NtMHX1和NtMHX2基因的克隆及不同金属离子胁迫下的表达模式分析

[目的]研究Magnesium proton exchangers (MHX)基因在烟草(Nicotiana tabacum)中的特性与功能.[方法]采用同源克隆方法,从栽培烟草K326中克隆MHX基因,对其编码蛋白进行了生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测MHX基因在不同烟草组织及金属离子处理0d、1d、2d、...     

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。      

烟草根黑腐病抗性位点RBRR1的InDel分子标记开发与分析

  背景和目的  RBRR1是通过远缘杂交与回交导入栽培烟草的一个单显性广谱型根黑腐病抗病位点,为了开发基于该位点的简单高效稳定且成本低的紧密连锁分子标记。  方法  在已有酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS）标记相关序列基础上,利用云晒1号基因组与抗、感根黑腐病材料重测序信息,基于其序列插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）多态性设计抗病相关分子标记,并开展遗传效应和遗传变异分析。  结果  筛选到4对具有良好多态性的引物,在目标单株的分子标记辅助选择中具备便捷、高效且呈共显性的特点。遗传效应分析表明,通过分子标记辅助选择导入RBRR1位点能够极显著提高栽培烟草根黑腐病抗性。遗传变异分析结果显示,在烟草核心种质资源中仅有白肋烟TN90和SoTa2携带有RBRR1抗病基因,并发现4对引物在普通烟草自然群体中呈现2种基因型。  结论  RBRR1抗病位点在我国尚未进行广泛利用,具有较高的利用价值;而开发的4个InDel标记可用于该抗性位点的分子标记辅助选择育种和后续抗病基因的精细定位与克隆。      

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。