烟草野火病菌特异性检测引物筛选及应用

烟草野火病是山东烟区主要的细菌性病害之一,为了能够对该病害进行精确、快速的分子鉴定,本研究从NCBI基因组数据库中下载了假单胞菌属25个不同菌种和127个丁香假单胞菌属不同致病变种的全基因组数据,利用Mauve 2.3.1进行全基因组比对,获得丁香假单胞菌烟草致病变种特异性区段。在此基础上利用Primer Premier 6.0进行引物设计,筛选出了一对丁香假单胞菌烟草致病变种的特异性检测引物40429。利用7株山东不同烟区的烟草野火病菌和4株分别来自于贵州、湖北、福建及云南的烟草野火病菌进行了该引物的适用性验证,结果表明该引物均可扩增得到大小为203 bp的单一目的条带。说明该引物对于烟草野火病菌的检测具有良好的适用性,可以用于野火病菌的分子鉴定。     

烟草青枯病抗性基因的遗传分析及RAPD标记

选用高感青枯病品种"红花大金元"与高抗青枯病品种"Ti448A"配制杂交组合,采用温室苗期叶片人工注射法接种鉴定两亲本及其杂交后代F₁、F₂、BC₁P₁代的青枯病抗性表现,结果表明抗病亲本材料Ti448A的抗病性由一对显性基因控制。依据混合群体分组分析法(BSA)建立抗青枯病基因池和感青枯病基因池,通过RAPD试验,从近200个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物S503,用双亲、F₁、F₂单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记,利用JOINMAP (version 1.4)软件计算得此标记与抗青枯病基因间的重组率为5.984%,连锁距离为6.261 cM。      

RAPD标记在烟草研究中的应用

随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNAs,RAPD)分子标记技术的诞生,为分子生物学技术在农业研究中的应用注入了新的活力,并为传统农业研究向分子水平发展提供了捷径。本文重点综述了RAPD分子标记技术在烟草群体分离分析和鉴定、标记辅助选择、遗传变异的识别、烤烟品种分子指纹分析、黑胚病菌全基因组DNA多态性标记、根结线虫种类鉴定、赤星病菌的分类地位等方面的研究进展,以及这些领域的研究发展和应用前景。      

烤烟品种的RAPD引物筛选

本试验筛选出了45个引物,可产生遗传多样性,其中OPA-08、OPA-16、OPC-10、OPC-12、GENMES'S 36号、78号、112号、181号引物其扩增结果稳定性好、多态性强。这些引物的RAPD扩增结果都可作为烟草烤烟品种的遗传多样性分析、基因定位及分子标记等。经凝胶电泳比较,GENMED'S 36号引物可作为烟草品种的最适宜的引物;1.8kb条带被初步认为与抗黑胫病基因相关。这些结果为以后对烟草烤烟品种在分子水平上的研究奠定了基础,加速烟草烤烟品种分子水平上的研究进程      

烟草鸢尾丝囊霉菌的生物学特性及分子检测

针对近年来河南省许昌、洛阳、三门峡等部分烟区烟草漂浮苗鸢尾丝囊霉根腐病发生较重的问题,采用菌丝生长速率法初步分析了病原菌的生物学特性,并根据NCBI数据库中鸢尾丝囊霉菌代表菌株CBS 524.87的5个编码基因CDS序列,设计筛选鸢尾丝囊霉菌的特异性扩增引物并应用。生物学特性分析结果表明,在PDA培养基上,鸢尾丝囊霉菌菌丝生长的适宜温度为25～35℃,致死温度为50℃,处理10min;生长适宜pH为4.0～8.0,最适pH为6.0;连续光照条件有利于菌丝生长。筛选获得了特异性扩增鸢尾丝囊霉菌的引物对7个,对于基因组DNA扩增的灵敏度约为0.182 ng/μL;利用特异引物AiT3分别对接种育苗基质和烟苗进行分子检测,可特异性的检测出鸢尾丝囊霉菌,检测的灵敏度分别为每克基质含菌量为2.5×10^-2 g病原菌菌丝和0.5 ng/μL烟苗根系基因组DNA。本研究为鸢尾丝囊霉菌的快速分子检测提供了技术支撑,对苗期鸢尾丝囊霉根腐病病原的准确识别和预测预报提供了依据。     

烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选及鉴定

为筛选出烟草青枯菌的有效拮抗菌,本研究从烟草根围土壤中分离了97株放线菌,通过平板对峙培养法筛选出抑菌圈直径均达20 mm以上的拮抗放线菌3株.根据其在鉴别培养基上的培养特征、孢子和孢子链的形态特征,生理生化特性以及16SrDNA序列分析对这3株拮抗放线菌进行鉴定.结果表明,3株拮抗放线菌都属于链霉菌属(Streptomyces),分别为粉红孢类群中的玫瑰暗黄链霉菌(S. roseofulvus Preobrazhenskaya)、绿色类群中的橄榄绿链霉菌(S. olivaceoviridis Preobrazhenskaya)和灰褐类群中的黄麻链霉菌(S. corchorusii Ahmed).其中,玫瑰暗黄链霉菌菌株对青枯劳尔氏菌的拮抗效果最好,其平均抑菌圈直径可达54.66 mm;橄榄绿链霉菌菌株的拮抗效果次之,其平均抑菌圈直径为43.20 mm;黄麻链霉菌平均抑菌圈直径为20.34 mm.     

烟草黑胫病菌全基因组DNA遗传多态性RAPD标记

应用ＲＡＰＤ分子标记技术,从８０个随机引物中筛选出１０个分别为ＯＰＡ０２、ＯＰＡ０１３、ＯＰＡ０１４、ＯＰＡ０１６、ＯＰＡ０１８、ＯＰＢ０４、ＯＰＢ０５、ＯＰＤ０２、ＯＰＤ０３、ＯＰＤ０１１,对来自云南省６大主产烟区的２４个烟草黑胫病菌株全基因组ＤＮＡ进行随机扩增。结果表明：１０个引物共标记出８９条ＲＡＰＤ图带,其中多态性图带６３条,多态率７０．７％。引物ＯＰＤ０１１、ＯＰＤ０２、ＯＰＡ０１６、ＯＰＢ０４对每个受试样品均可标记出分子量为０．８７Ｋｂ和１．１Ｋｂ的ＤＮＡ片段,此４个引物对受试样品全基因组ＤＮＡ具有特征性分子标记的特性,利用核酸分子杂交技术对田间寄主体内的黑胫病菌的有无进行分子检测。被标记出的分子量为０．８７Ｋｂ和１．１Ｋｂ的特征性ＤＮＡ片段,可用来制备特异性探针,对田间烟草黑胫病菌发生动态进行检测和预报。     

烟草青枯病菌生理分化的研究

1996年～1997年从福建和贵州两省采集分离30个菌株，在田间分区组用21个菌株做接种鉴定。依据它们在一套鉴别品种上的反应，可以区分为致病力强弱不同的4个苗系群，其中Ⅰ群最弱，Ⅳ群最强。福建省以Ⅲ群首系占优势，出现频率75％，贵州省则以Ⅳ群苗系占优势，出现频率达76．9％，该苗系对K326品种有很强的致病力，这是导致近年来该省部分地方K326品种成片枯死的主要原因。生理生化反应测定表明，30个菌株均能利用3种双情和3种已醇，但在硝酸盐还原上显示出有能否产气的明显差异。30个菌株在L-酪氨酸培养基上均能产生褐色素，但产生的量有明显差异。细菌素测定表明，30个菌株对指示窗的拮抗率达83．3％。     

烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)细菌素的生物学特性研究

本文研究了烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)无毒产细菌素菌株 A_(3-5)产生的细菌素的生物学特性,结果表明,用不同制备方法提取的 A_(3-5)的细菌素,Au 值均为8。失活温度为60℃,在30℃以下温度放置25天抑菌活性不变,35℃下放置20天,活性开始减弱,40℃放置10天,活性即减弱,25天对几乎完全失活。这说明 A_(3-5)的细菌素虽具有较强耐热能力,但高温不利于其存活。此外,0.5%的胰蛋白酶即刻使其完全失活,说明对胰蛋白酶敏感。经1万转/分钟和5万转/分钟连续离心后,细菌素仍存在于上清液中,说明为非沉淀性的。以上特性表明 A_(3-5)的细菌素可能是一种小分子物质。     

烟草青枯病菌对4种杀菌剂的敏感性及复配药剂联合毒力评价

为筛选出对烟草青枯病菌具有抑制作用的高效药剂,以链霉素为对照,采用生长曲线测定仪检测了烟草青枯病菌对氟啶胺、双苯菌胺、噻霉酮和春雷霉素的敏感性,并利用Wadley方法对氟啶胺与纳米硫、纳米铜、纳米银的9种复配比例进行联合毒力评价。结果表明,双苯菌胺和氟啶胺对烟草青枯病菌的平均EC₅₀分别为0.037 8 μg/mL和0.305 0 μg/mL,EC₅₀分布范围分别为0.018 7~0.053 4 μg/mL和0.147 1~0.890 4 μg/mL,链霉素、噻霉酮和春雷霉素对烟草青枯病菌的平均EC₅₀分别为0.546 3 μg/mL、2.429 9 μg/mL和9.927 3 μg/mL,说明杀真菌药剂氟啶胺、双苯菌胺可有效抑制青枯病菌生长,且抑菌效果优于链霉素等药剂。5种药剂对烟草青枯病菌的敏感基线均呈正态分布,为连续的单峰曲线,可用于田间烟草青枯病菌抗性菌株监测。氟啶胺与纳米农药按不同比例复配后的EC₅₀均小于纳米农药单剂的EC₅₀。当氟啶胺与纳米硫按体积比1 ∶ 40复配时具有增效作用,增效系数为1.60;氟啶胺与纳米铜按体积比80 ∶ 1复配时,相加作用最为明显（EC₅₀=0.142 2 μg/mL）;氟啶胺与纳米银的复配比例（体积比）为1 ∶ 20时,增效系数最高达1.41,具有相加作用。      

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。      

鉴别烟草属植物的特异PCR引物研究

[目的]为科学、高效鉴别检测涉案制烟原料中是否含有烟草材料.[方法]利用公共数据库中烟碱代谢途径相关基因序列和茄科基因组数据(含烟草未公开数据)开发分子标记,通过对3个烟草亚属11个组的91份烟草材料和17份非烟草材料进行实验验证,获得烟草属特异性扩增分子标记.[结果]从209对新开发的引物中筛选出2对稳定、可靠且具有...     

Development of novel species‐specific primers for species identification of the Lactobacillus casei group based on RAPD fingerprints

BACKGROUND: It is difficult to clearly distinguish and identify specific species of the Lactobacillus casei group using phenotypic and genotypic (16S ribosomal DNA sequence analysis) techniques alone. Some species of this group are probiotic and are widely used in the food and feed industries. The objective of this study was to develop species‐specific primers based on randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting for species identification within the closely related L. casei group of bacteria. RESULTS: Three random primers termed OPT‐14, OPA‐11 and OPT‐16 were developed for analysis. The primer pairs each produced a species‐specific band found only in the tested Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei subsp. tolerans and Lactobacillus zeae isolates respectively. These specific fragments were then sequenced for further analysis. The species‐specific primers were designed according to cloned sequencing, which was employed for polymerase chain reaction (PCR) with the template DNA of Lactobacillus strains. Single 102, 179 and 451 bp species‐specific bands were found only in L. rhamnosus, L. paracasei subsp. tolerans and L. zeae respectively. CONCLUSION: Using PCR, the novel species‐specific primers have been shown to rapidly, accurately and effectively identify species of L. rhamnosus, L. paracasei subsp. tolerans and L. zeae from within the L. casei group of probiotic bacteria. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

基于膜技术的桑葚多糖分级分离及生物活性组分筛选

采用了膜技术分级分离桑葚多糖（Mori fructus polysaccharide,MFP）,并探究了不同分子量桑葚多糖的抗氧化、降血糖、抗过敏和体外乙醇脱氢酶活性。以桑葚为原料,通过热水浸提后采用300、50、5和1 kDa超滤膜对桑葚多糖进行分级分离,分别记为MFP300、MFP50、MFP5和MFP1。比较4种孔径的超滤膜分离的桑葚多糖组分主要成分、抗氧化活性、降血糖活性、抗过敏活性和体外乙醇脱氢酶活性的差异。结果表明,4种多糖的主要成分和生物活性表现出一定的差异。MFP1、MFP5、MFP50和MFP300的总糖含量分别为46.34%、68.45%、48.60%和66.32%,糖醛酸含量分别为3.34%、22.78%、16.11%和21.48%,还原糖含量分别为16.51%、6.03%、7.90%和6.67%。生物活性筛选表明,MFP300清除DPPH自由基和ABTS+自由基的IC₅₀值分别为0.2235和0.2979 mg·mL?1,抑制透明质酸酶能力的IC₅₀值为0.6634 mg·mL?1,激活体外乙醇脱氢酶能力的IC₅₀值为10.2646 mg·mL?1,表现出最好的抗氧化、抗过敏和体外乙醇脱氢酶活性。MFP1抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶能力的IC₅₀值分别为0.7944和4.6419 mg·mL?1,表现出最好的降血糖活性。综上所述,经膜技术分级分离得到的不同分子量范围的桑葚多糖在主要成分和生物活性方面有一定差异,为桑葚多糖分级技术的改进升级和桑葚多糖“构-效”关系研究提供理论基础。     

PorA specific primers for the identification of Campylobacter species in food and clinical samples

Campylobacteriosis is a public health problem with considerable socio-economic impact. As the European Food Safety Authority has emphasized the importance of a surveillance programme for campylobacteriosis, the aim of the present study was the optimization of a specific and sensitive PCR protocol able to detect Campylobacter species responsible for gastrointestinal infections. Raw poultry meat samples were analysed for the presence of Campylobacter sp., by plating onto mCCD (Modified Charcoal-Cefoperazone-Deoxycholate) Agar and Campylobacter Selective Preston Agar and using four sets of species-specific primers for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter upsaliensis and Campylobacter lari designed to bridge the porA gene. The resulting primers demonstrated a sensitivity of 0.01 ng/μl for the C. coli-specific, C. lari-specific, and C. upsaliensis-specific primer sets and 0.5 ng/μl for the C. jejuni-specific primer sets using DNA from pure cultures. Non-specific amplification of non-target DNA was not observed indicating excellent specificity. The primers were useful for the analyses of poultry meat samples both for direct plating onto mCCDA, and for DNA extracted directly from the cells grown for 48 h in Preston enrichment broth. The sets of primers were also useful when used for species identification of human isolates.     

基于液质联用和分子对接技术对薄蒴草抗炎活性成分的筛选

目的:基于液质联用及分子对接技术筛选薄蒴草中的抗炎活性成分。方法:通过研究薄蒴草不同极性萃取部位对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW 264.7产生一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的影响,筛选薄蒴草抗炎活性部位。通过高效液相色谱-质谱联用技术（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）分析抗炎活性部位的化学成分。选择5个重要的炎症因子TNF-α、IL-6、白细胞介素-1β（IL-1β）、前列腺素E₂（PGE₂）、核转录因子-κB（NF-κB）分别与活性部位中的有效成分通过Autodock Vina软件进行分子对接。结果:体外抗炎实验结果显示薄蒴草的乙酸乙酯萃取部位具有一定的抗炎活性,与模型组相比在最高实验浓度75 μg/mL下对NO、TNF-α、IL-6的产生均有极显著抑制作用（P<0.01）,抑制率分别为63.53%、34.23%、34.58%;液质联用鉴定出11个化学成分,包括8个黄酮类成分芦丁、牡荆素、山奈酚、鼠李秦素、槲皮素、芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖苷、槲皮苷和3个香豆素类成分伞形花内酯、7-甲氧基香豆素、5,7-二羟基香豆素;分子对接结果显示,与TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE₂、NF-κB结合最好的成分分别是槲皮苷、山奈酚、芦丁、槲皮苷、牡荆素,结合能为?8.5、?7.8、?8.0、?7.2和?10.0 kcal/mol,均优于阳性对照地塞米松,说明这些成分与5个靶点具有较好的亲和力。结论:薄蒴草的乙酸乙酯萃取部位为抗炎活性部位,通过液质联用结合分子对接技术能快速、便捷地筛选出薄蒴草的抗炎活性成分。     

可降胆固醇的优势乳杆菌筛选

为丰富降胆固醇、降血糖的益生菌资源,以实验室10株潜力益生菌株为实验对象,进行体外降胆固醇能力、胆盐水解酶(BSH)活性及α-葡萄糖苷酶抑制率试验,测定菌株对人工胃液和胆盐的耐受性,评价优势菌株的细胞黏附性能及对抗生素的耐药安全性能。结果表明,植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4对胆固醇的降解率在50%以上,显著高于商业菌株植物乳杆菌299V(p<0.05)。植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌SD-H9对α-葡萄糖苷酶的抑制率高达41.7%、40.1%。植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4、植物乳杆菌10-14、卷曲乳杆菌OF48-2pH5这5株菌具有较好的BSH活力、α-葡萄糖苷酶抑制性、抗逆性以及对HT-29细胞的黏附能力。但仅植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5通过了10种抗生素的安全性试验。综上所述,植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5具有较好的降胆固醇、降血糖潜力,且通过了抗逆性、黏附性、安全性试验,可用于进一步的开发和应用。     

3株拮抗烟草尖孢镰刀菌的木霉菌筛选鉴定及促生防病效果评价

  目的  为筛选对烟草镰刀菌根腐病菌具有较好拮抗效果的菌株。  方法  从河南省主要烟叶产区健康烟株根际土壤中,分离纯化对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有一定拮抗作用的真菌菌株,对筛选出的拮抗菌株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定促生作用和防治效果。  结果  分离纯化得到的3株木霉菌分别为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）Ta-0101、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）Th-0201和毛簇木霉（Trichoderma velutinum）Tv-0207,具有较强的抑菌能力,对尖孢镰刀菌的抑菌率分别为91.24%、84.71%和82.48%。3株木霉菌对烟草种子根长和总长均有显著的促生效果,根长增长率分别为28.89%、25.92%和22.22%,根系活力也显著提高;对烟株最大叶面积和鲜重的促生作用明显,其中棘孢木霉Ta-0101促生效果最显著。3株木霉菌对尖孢镰刀菌的相对盆栽防效分别为78.95%、69.73%和69.73%,均高于70%甲基硫菌灵1000倍液处理的防效。  结论  3株拮抗木霉菌具有较好的抑菌效能和促生防病效果,应用前景良好。      

基于Red重组系统的阴沟肠杆菌基因重组技术

目的:开发一种基于Red重组系统的E.cloacae基因重组技术。方法:将Red重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-red,将Flp重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-flp。以budA基因(编码乙酰乳酸脱羧酶)为例,构建了不同长度同源臂的抗性盒。将这些DNA片段分别转化入携带pSC-MSC-red质粒的E.cloacae进行基因重组。结果:使用同源臂长度为39和100 bp的抗性盒不能得到重组子;同源臂长度为200 bp的抗性盒可以获得重组子E.cloacae ΔbudA-773,重组效率为6.1 CFU/μg DNA;同源臂长度为500 bp时,重组效率提高到131.5 CFU/μg DNA。将表达Flp重组酶的质粒pSC-MSC-flp转化入重组菌株中传代培养成功消除了抗性标记。对重组菌株E.cloacae ΔbudA进行发酵培养实验,菌株丧失了合成乙偶姻和2,3-丁二醇的能力,表明budA基因被成功敲除。结论:本文建立了一种适用于E.cloacae的基因重组方法。