烟草根际促生菌(PGPR)的筛选、鉴定及促生机理研究

筛选并鉴定了贵州烟区烟草根际促生菌（PGPR）菌株。测定PGPR产激素能力、定殖能力以及对烟草苗期促生作用，以具备多项促生能力为筛选标准，确定目标PGPR，再通过16S rDNA、平板对峙以及PCR技术对目标PGPR进行属鉴定、抗病能力测定。通过筛选获得的7株目标PGPR均能产生脱落酸、细胞分裂素、赤霉素和生长素。烟苗盆栽试验表明7株PGPR均具有促生效果，其中LX-7处理的烟苗鲜重和根系活力最大；大田移栽30d后，LX-7根际定殖数量可维持107cfu/g根，显著高于其它菌株；抑菌试验证实LX-4、LX-5和LX-7具有广谱抗菌作用。综合考量，LX-4、LX-5和LX-7具有显著的促生效果，经16SrDNA鉴定分别为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。      

两株生防菌对烟草黑胫病的抑制活性及其鉴定

为测定烟草黑胫病生防菌K9-3和L14-2两菌株的生防潜力,通过对峙培养法、孢子萌发试验和盆栽试验测定对烟草黑胫病病原菌的抑制能力,以双层滤纸法和盆栽检测法测定在烟草根际定殖能力,并根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,鉴定K9-3和L14-2两株生防菌。结果表明:在室内试验中,这两株生防菌可抑制烟草黑胫病病原菌菌丝的生长、游动孢子囊的形成、游动孢子的释放和休止孢子的萌发;在盆栽试验中,有效防治烟草黑胫病,L14-2对烟草黑胫病的防治效果达到96.29%,K9-3的防治效果为77.78%。同时,K9-3和L14-2均具有良好的根际定殖能力,以双层滤纸法测定其在烟草根部的定殖密度分别为1.30×105cfu.cm-1和7.00×104cfu.cm-1,在盆栽试验中两菌株在烟草根际土壤和烟草根部保持一定的定殖密度,在烟草根际土壤中的定殖密度随着时间经过有所下降,但在烟草根部定殖密度均稳定保持在105cfu.g-1以上。另外,两菌株的鉴定结果,K9-3鉴定为普城沙雷菌,L14-2鉴定为绿针假单胞菌。     

三株芽孢杆菌的生防特性研究

为明确贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）GY1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GY10和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GY12的生防特性,采用平板试验法、对扣法、盆栽试验等,对三株生防菌的抑菌谱、次生代谢产物、挥发性物质、根际定殖能力和促生能力等进行了研究。结果表明,GY1、GY10、GY12培养液可以显著促进烟草种子的萌发和烟株的生长;三株生防菌抑菌谱广,对烟草赤星病菌、黑胫病菌及花生镰刀菌等9种病原具有显著的抑制作用,并且都具有分泌嗜铁素和蛋白酶的能力;三株生防菌发酵上清液和挥发性物质对链格孢菌（Alternaria alternata）和烟草疫霉菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）具有显著抑制作用;菌株的分泌蛋白热稳定性好,对烟草赤星病菌具有显著的体外抑菌活性,并对酸性环境具有较高的耐受性;根际定殖结果表明,GY1-GY10-GY12复配与单菌株相比能增加各生防菌在烟草根际的定殖。以上结果对于菌株GY1、GY10、GY12生防特性的深入挖掘和产业化开发具有一定的指导作用。     

3株拮抗烟草尖孢镰刀菌的木霉菌筛选鉴定及促生防病效果评价

  目的  为筛选对烟草镰刀菌根腐病菌具有较好拮抗效果的菌株。  方法  从河南省主要烟叶产区健康烟株根际土壤中,分离纯化对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有一定拮抗作用的真菌菌株,对筛选出的拮抗菌株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定促生作用和防治效果。  结果  分离纯化得到的3株木霉菌分别为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）Ta-0101、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）Th-0201和毛簇木霉（Trichoderma velutinum）Tv-0207,具有较强的抑菌能力,对尖孢镰刀菌的抑菌率分别为91.24%、84.71%和82.48%。3株木霉菌对烟草种子根长和总长均有显著的促生效果,根长增长率分别为28.89%、25.92%和22.22%,根系活力也显著提高;对烟株最大叶面积和鲜重的促生作用明显,其中棘孢木霉Ta-0101促生效果最显著。3株木霉菌对尖孢镰刀菌的相对盆栽防效分别为78.95%、69.73%和69.73%,均高于70%甲基硫菌灵1000倍液处理的防效。  结论  3株拮抗木霉菌具有较好的抑菌效能和促生防病效果,应用前景良好。      

土壤中烟草根黑腐病菌的real-time PCR分子检测

根据烟草根黑腐菌与其它近缘真菌在ITS序列上的差异,设计PCR检测引物TbF/TbR,并通过对各菌株基因组DNA扩增验证其特异性;以接种10倍浓度梯度的根黑腐菌孢子的土壤DNA为模板,建立土壤烟草根黑腐菌real-time PCR检测的标准曲线,得出每个反应体系中分生孢子数目的对数（x）和对应的Ct值（y）之间呈线性关系:y=-1.5373x+24.955,R2=0.9909（P < 0.01）。通过对5块烟田土壤烟草根黑腐菌检测和烟田烟草根黑腐病的调查,证实上述方法可以准确检测土壤中烟草根黑腐菌孢子数量。      

纳米硒化荧光假单胞菌KBD-1菌株对烟草病毒病的抑制作用

为挖掘具有纳米硒化能力的生防菌株,开发烟草病毒病的绿色防治材料,从烟草病毒病重病田块健株根际土壤中筛选获得到一株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens KBD-1,对其进行了纳米硒化,采用Real-time PCR和Western blot测定了两者对烟草常见病毒基因表达的影响,并采用接种法测定了其对烟株相应病毒病的防治作用。结果表明,纳米硒化后的KBD-1菌体外部存在高密度电子颗粒,在X射线11.22 keV处出现硒的特征吸收峰。纳米硒化后的P.fluorescens KBD-1菌液浓度在5×10⁵ cfu/mL（单质硒浓度0.25 mg/L）时,对烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）4种病毒病的防治效果均在88.0%以上,对CMV防治效果最高达91.4%,该浓度处理对烟株促生效果显著。荧光假单胞菌KBD-1可成功将亚硒酸钠还原生成纳米硒,并能增强原始菌株的抗烟草病毒活性和促生效果。     

巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium，Bm）的抑菌活性及定殖规律分析

为进一步明确巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium,Bm）菌株对烟草主要病害的抑制效果,利用半叶法、对峙平板法和抑菌圈法研究了Bm对烟草花叶病毒（TMV）、黑胫病菌和青枯病菌的抑制作用;利用抗生素诱导筛选抗药性标记菌株,研究其在烟草根际土壤和叶面上的定殖规律;同时制备了生防菌发酵液制剂,测定其田间防治效果。结果表明:Bm发酵液和发酵上清液对烟草花叶病毒的抑制率分别为88.4%和74.3%;Bm无菌发酵上清液对黑胫病菌菌丝生长的抑制率为67.5%,对青枯病菌的抑菌圈直径为10.03 mm。抗药性菌株Bm-rif生长性状与野生型无差异。室内定殖试验结果显示,Bm-rif稳定定殖菌量在非灭菌土壤中为0.04×105 cfu/g,在灭菌土壤中为0.47×105 cfu/g,均显著高于叶面定殖菌量;接种TMV-GFP前24 h叶面喷施发酵液对TMV初侵染的抑制率为44.04%。菌株发酵液稀释后喷淋烟株茎基部,对烟草黑胫病和青枯病的田间防治效果分别为68.09%和51.02%。因此,Bm具有抑菌活性且能在烟草根际土壤中有效定殖,具有开发为生防菌剂的潜力。      

淡紫拟青霉在烤烟根际定殖能力分析

通过盆栽试验,确定了烟草根结线虫生防菌淡紫拟青霉IPC菌株在烤烟K326和云85根际的生长和定殖情况及其对根际微生物的影响.结果表明,施入菌剂2周和4周时淡紫拟青霉IPC菌株能在烤烟K326外根际、根表分离到,根内则不能分离到;而不同时期在烤烟云85的外根际、根表和内根际都能分离到.在6周时2种烤烟的外根际、根表和根内的分离数达到最大,8周时分离数减少.每个时期在2种烟草根际分离到IPC菌株的菌落繁殖单位(CFU)都是外根际最大,其次是根表,内根际最小.IPC菌剂处理后烤烟根际细菌、真菌和放线菌的数量在2周比对照减少,4周时比对照增多,6周和8周时与对照接近.表明生防菌淡紫拟青霉IPC菌株可以在烟草外根际、根表定殖和生长,而在根内则较困难,菌剂施用2周时对根际土壤微生物具有一定的抑制作用,4周后抑制作用减弱.     

荧光假单胞菌YG-1对烟草根黑腐病菌的体外拮抗

为丰富烟草根黑腐病菌高效拮抗菌资源,从玉溪烟草种植区根际土壤中分离烟草根黑腐病高效拮抗菌,结合生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定高效拮抗菌,测定菌株发酵液挥发性物质及发酵液粗提物对根黑腐病菌的拮抗活性。结果表明,筛选得到的12株拮抗菌中YG-1表现出最强的拮抗活性,经生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluroescens）。菌株YG-1发酵液挥发性物质可有效抑制烟草根黑腐病菌的生长,使菌丝扭曲畸形,并且降低产孢量,经GC-TOF-MS测定,YG-1发酵液含有酸、醛、酯以及一些含硫化合物,其中酸类物质和含硫化合物抑菌效果强。菌株YG-1发酵液粗提物能破坏烟草根黑腐病菌孢子质膜,当粗提物质浓度为0.25 mg/mL时,孢子失膜率达55.42%,同时检测到有明显的离子和核酸渗漏。拮抗菌YG-1具备开发为生防菌剂的潜力。     

两株烟草根际拮抗菌的生防和促生效果研究

使用植物根际促生细菌(PGPR)来防治土传病害是目前生物防治的研究热点。在温室内进行盆栽试验以研究从烟株根际筛选出的两株生防细菌对烟草黑胫病的防治和促生效果,试验设4个处理,分别为接种生防菌YC0573、YC0136、药剂对照(甲霜灵锰锌)和发病对照。结果表明,温室条件下YC0573和YC0136的防治效果分别达到90.9%和95.4%,均高于甲霜灵锰锌(86.4%);接种生防菌的烟株生长状况明显好于对照烟株。对不同生长期烟株叶片叶绿素含量、电解质相对渗透率以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶等系统抗性相关指标进行测定,结果显示,两株拮抗菌可诱导烟株产生系统抗性(ISR),增强对病害的防御力,并且能有效防治烟草黑胫病,促进烟株生长,具有良好的应用潜力。     

解淀粉芽孢杆菌施用方式对烟株根际土壤真菌群落的影响

通过大田试验和ITS扩增子测序技术,研究了解淀粉芽孢杆菌不同施用方式[兑水灌根（DS）、拌土围根（BT）、米糠+拌土围根（MK+BT）]对烟株根际土壤真菌群落的影响,旨在为解淀粉芽孢杆菌的科学施用提供理论基础。结果表明,BT和MK+BT均可显著提高烟株根际土壤真菌群落OTU数量及Sobs、Shannon、Chao1指数,对烟株根际土壤真菌群落结构具有显著影响,提高了土壤中子囊菌门和担子菌门的相对丰度,促使土壤中毛壳属（Chaetomium）、木霉属（Trichoderma）和赤霉菌属（Gibberella）等一些有益微生物比例上升。综合来看,在改善根际土壤真菌群落的作用中,MK+BT > BT > DS。     

抗烟草疫霉活性木霉与芽孢杆菌共培养体系的构建与优化

为减轻化学药剂防治烟草疫霉带来的弊端,提高生防菌剂效果,通过琼脂糖扩散法筛选抗性木霉并构建木霉和枯草芽孢杆菌Tpb55共培养体系,采用菌丝生长速率法评价了种间互作防治烟草疫霉的效果,利用单因素法优化共培养体系的培养基成分和发酵条件,并通过盆栽试验验证其对烟草黑胫病的防治效果。结果表明,棘孢木霉HG1具有良好的抗烟草疫霉活性,与枯草芽孢杆菌Tpb55的共培养体系如下:HG1(10⁶CFU/mL)接种量为2%,与Tpb55(10⁶CFU/mL)接种比例为10:1,采用序列共培养方式,即先接种HG1,24h后接种Tpb55。优化后的最适培养基成分为木糖10 g/L,蛋白胨和酵母粉(质量比为2:1)5g/L;最佳发酵为温度25℃,初始pH7.5,转速140r/min。共培养发酵液盆栽防病效果显著优于单培养,防治效果达到74.72%。该体系发酵后能够明显提升两株生防菌抑制烟草疫霉的活性,并对烟草黑胫病具有显著防病效果,为后续多菌株共发酵生防菌剂的开发提供基础。     

烟草甲幼虫高毒力病原真菌的筛选

为筛选出对烟草甲2龄幼虫具有较好防治效果的病原真菌,在实验室条件下,采用浸渍法测定5株蜡蚧轮枝菌和5株球孢白僵菌对烟草甲2龄幼虫的毒力,筛选出2株对烟草甲2龄幼虫具有高毒力的白僵菌菌株Bb05和Bbr81,将2株菌株配置成不同浓度的孢子悬浮液,测定其毒力并对Bb05菌株的侵染过程进行观察。结果表明,接种孢子浓度1.0×10⁸mL^-1条件下,菌株Bb05处理烟草甲的累积死亡率最高,达77.78%,LT₅₀为8.18 d;菌株Bbr81处理烟草甲的累积死亡率为74.44%,LT₅₀为7.60 d。用不同浓度孢子悬浮液处理烟草甲2龄幼虫后,其累积死亡率随孢子浓度和接种时间的增加而增加,Bb05菌株的LC₅₀为8.3×10⁷ mL^-1,菌株Bbr81的LC₅₀为1.2×10⁷ mL^-1。筛选所得的2个菌株对烟草甲虫2龄幼虫的毒力较高,具有一定的开发应用潜力。     

烤烟根腐病对烟株根际土壤真菌群落结构的影响

为从微生物生态学角度探求烤烟根腐病的发生原因并为其防控提供理论依据,利用Illumina MiSeq高通量测序分析了烟草根腐病发病和健康植株根际土壤真菌群落结构的差异,结果表明,烤烟根腐病发生对烤烟根际土壤真菌的丰富度有显著影响,其中健康和患病烟株根际土壤样品中真菌OTU数分别为904个和647个,健康烟株真菌OTU总数为患病烟株的1.40倍,特有OTUs数是患病烟株的2.59倍;患病烟株根际土壤真菌群落多样性水平显著低于健康烟株土壤,患病烟株根际土壤的Shannon、ACE和Chao1指数分别较健康植株降低了29.81%、40.12%和40.61%;同时,患病烟株与健康烟株根际土壤真菌群落的优势物种显著不同,患病烟株根际土壤中烤烟根腐病病原菌茄镰刀菌（F.solani）相对丰度较健康烟株根际土壤增加了303.45%,为健康烟株的4.03倍,且棘孢木霉（Trichoderma asperellum）和青霉菌（Penicillium raperi）的相对丰度亦较健康烟株分别增加了17.62%和50.46%。烟草植株根际土壤中真菌群落结构改变及物种多样性降低是烤烟根腐病发生的重要特征。研究可为该病害的早期预防或生态调控提供科学依据。     

短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂协同防治烟草青枯病研究

为探究短小芽孢杆菌与化学杀菌剂联合防控烟草青枯病的可行性,分别采用改良抑菌圈法和平板菌落计数法测定7种杀菌剂和短小芽孢杆菌AR03对青枯雷尔氏菌的毒力及杀菌剂与AR03的生物相容性,同时采用Horsfall法确定杀菌剂和AR03的复配比例。室内毒力试验结果表明,7种杀菌剂和AR03对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用。7种杀菌剂的毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、溴菌·壬菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌和中生菌素,EC₅₀值介于101.02~212.70 mg/L之间。浓度为1.0×10⁵~1.0×10⁹ cfu/mL的AR03对青枯雷尔氏菌的抑菌率介于26.13%~73.54%之间,呈现浓度依赖性。生物相容性分析发现7种供试药剂与AR03的生物相容性差异较大,短小芽孢杆菌AR03与噻菌铜、噻唑锌、甲霜·福美双生物相容性较好,尤其是噻菌铜表现最好,测试浓度100 mg/L时,菌落数大于1×10⁷cfu/mL。综合杀菌剂对青枯病菌的毒力及其与AR03生物相容性,噻菌铜表现最优。噻菌铜（EC₅₀=175.21 mg/L）与AR03（EC₅₀=6.84×10⁶ cfu/mL）复配剂在体积比为5∶5时,对青枯雷尔氏菌的抑制效果显著,增效作用明显,增效比率值I_R值为1.482。室内盆栽试验结果表明,菌药复配剂的防效（68.77%）明显优于单剂噻菌铜和生防菌AR03的防效,且混配剂中噻菌铜使用量只有单剂的1/2,大幅降低了化学药剂的使用量。     

寡雄腐霉与氟噻唑吡乙酮协同防治烟草黑胫病研究

为了探究寡雄腐霉(Pythium oligandrum,PO)与氟噻唑吡乙酮(Oxathiapiprolin,OX)联合防控烟草黑胫病的可行性,采用菌丝生长速率法和平板对峙法分别测定了PO和OX的生物相容性,及OX、PO和OX+PO对黑胫病菌的毒力,并通过盆栽试验分别测定了OX、PO和OX+PO对烟草黑胫病菌的防效,以及对烟草幼苗的促生效应。生物相容性试验结果表明,不同浓度OX处理下,PO的生长速率与空白对照无显著差异。室内毒力结果显示,8.0×10^-3 mg/L OX对烟草黑胫病菌的抑制率为91%,EC₅₀为2.19×10^-3 mg/L,而OX(1.0×10^-3 mg/L)与PO联用的抑制率达96.31%。盆栽试验结果表明,OX+PO处理对烟草黑胫病的防效最高(84.57%),比OX(77.76%)或PO(76.54%)单独处理防效分别提高8.76%和10.49%。OX和PO联用对烟草促生效果显著,其株高、茎粗、叶长、叶宽分别比对照处理提高了57.10%、20.21%、33.62%、35.08%。...     

利用废弃烟梗发酵生产白僵菌的响应面优化

为实现废弃烟梗资源化利用,以废弃烟梗为主要发酵底料,白僵菌产孢量为响应值,采用响应面法（Response Surface Methodology,RSM）对烟梗发酵生产白僵菌的条件进行了优化。通过Plackett-Burman（PB）试验筛选出影响废弃烟梗发酵生产白僵菌最显著的因素,设计最陡爬坡试验逼近最佳条件区域,进一步设计Box-Behnken Design（BBD）响应面优化,分析并确定最佳条件。结果表明,当培养时间为9.40 d,蛋白胨含量1.21%,酵母粉含量1.03%时,白僵菌孢子产量预测最优值为1.17×10¹⁰个/g,实际孢子产量为1.13×10¹⁰个/g,拟合度达到96.58%,白僵菌产孢量显著提高。因此,采用该方法优化得到的最佳发酵条件合理而有效,对烟草生物防治以及烟梗废料的综合利用具有实际应用价值。     

Microbiological quality of ayib, a traditional Ethiopian cottage cheese

One-hundred samples of ayib, a traditional Ethiopian cottage cheese, were purchased from Awassa market and analysed for their aerobic mesophilic counts, psychrotropic counts, yeasts and molds, coliforms, spore-formers, enterococci, lactic acid bacteria, Listeria monocytogenes, staphylococci and Bacillus cereus. The majority of the samples showed counts of mesophilic aerobic bacteria, yeasts and enterococci of 10⁸, 10⁷ and 10⁷ cfu/g. About 55% of the samples were positive for coliforms and faecal coliforms. Listeria spp. were not detected in any of the samples. B. cereus and S. aureus were isolated at varying frequencies but at low numbers (10²–10³). The pH value of the samples varied between 3.3 and 4.6 with about 40% having pH lower than 3.7.