湖南烟草病毒病种类检测与系统进化分析

为明确湖南烟草病毒病的种类及分布状况,利用小干扰RNA（siRNA）测序和反转录PCR（RT-PCR）对湖南烟区样品进行检测,分析主要病毒侵染类型,最大似然法构建系统进化树确定分类地位。结果表明,湖南烟草受到烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）、地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus,ReMV）和辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMV）等6种病毒的侵染,其中ToMMV、ReMV、PMMV首次被检测到,TMV、CMV和PVY是主要病毒,TMV为优势病毒,复合侵染是主要侵染类型,复合侵染率为71.29%;湖南烟草上的TMV分离物形成3个独立组系,CMV分离物属群组I的亚组IB,PVY分离物属PVY^NTN-a、PVY^E和PVY^SYR-I株系。本研究摸清了湖南烟草病毒种类、分布及侵染情况,明确了TMV、CMV、PVY的分类地位,为病毒病的防治提供了理论依据。     

陕西洛南烟草病毒病毒原鉴定初报

2005年对洛南县田间发生的烟草病毒病进行了病原鉴定,结果共检出5种为害烟草的病毒,5种病毒为:马铃薯Y（PVY）、烟草普通花叶病毒（TMV）、烟草蚀纹病毒（TEV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草环斑病毒（TRSV）,其中烟草马铃薯Y病毒病和烟草普通花叶病毒病是当前生产上发病率较高、造成损失较大的2种病害;马铃薯Y病毒（PVY）和黄瓜花叶病毒（CMV）的复合侵染也是当前生产上亟待解决的主要问题。      

促烟草种子萌发的细菌菌株筛选及促生特性研究

以芽孢杆菌属、贪铜菌属、假单胞菌属及土壤杆菌属的7株细菌菌株对烟草K326种子进行浸种处理,通过测定发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数筛选到能够促进种子萌发的2株菌株;以钼蓝比色法测定培养液可溶磷含量,Salkowski法测定产IAA能力,CAS法测定分泌铁载体能力,对筛选出的2株菌的促生特性进行分析。结果表明,从贵州烟区土壤分离的2株高效氨化芽孢杆菌菌株可显著提高烟草种子的发芽指标,幼苗苗长显著高于未浸种处理。促生特性分析显示Bacillus toyonensis AMM-2和Bacillus mobilis AMM-5菌株的溶磷量分别为26.26和26.80 mg/L,产IAA的能力分别为21.57和7.40 μg/mL,铁载体分泌活性分别为35.08%和8.64%。研究显示,2株高效氨化细菌菌株具有优良的促生特性及显著的促种子萌发效应,可应用于烟草漂浮育苗,为促生有机肥的研制提供依据。     

烟草根黑腐病根际拮抗菌的筛选、鉴定及其促生防病效果

为挖掘对烟草根黑腐病菌有较高拮抗效果的根际促生菌资源,从四川广元和陕西汉中等地采集30份烟草根际土壤,以烟草根黑腐病菌为靶标,采用温度筛选法和平板对峙法分离筛选出有高效拮抗活性的菌株,并对该菌株进行系统发育分析,采用抗生素标记法和温室盆栽法测定菌株LY79的定殖规律、对烟草的促生效果以及对烟草根黑腐病的防治效果。结果表明：（1）从烟草根际土壤分离到一株烟草根黑腐病高效拮抗菌株LY79,经形态学、生理生化鉴定结合16S rRNA和持家基因ropB分析将菌株LY79鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。（2）抗生素标记菌株LY79^A在烟草根际土定殖规律为先下降后上升再下降最终趋于稳定,且施药40 d后仍能在烟草根际土、根系、茎、叶分离到1.34×10⁶、2.91×10⁴、1.81×10⁴、1.01×10⁴ CFU/g的菌株LY79^A,说明其定殖能力较强。（3）菌株LY79对烟草促生效果较好,处理60 d后,烟草的株高、茎粗、整株干质量、根干质量分别增加了34.68%、37.85%、103.79%、72.55%。（4）1×10⁹ CFU/mL浓度的菌株LY79发酵液对烟草根黑腐病的盆栽防效达71.54%,仅略低于对照药剂70%甲基托布津500倍液。解淀粉芽孢杆菌LY79在烟草根黑腐病防治中具有较大的应用潜力。     

种子携带病毒对烟草苗期病毒病发生的影响

为了有效控制烟草苗期病毒病,进行了种子携带病毒对烟草苗期病毒病发生的影响盆栽试验。取健康烟草种子用不同浓度的TMV、CMV和PVY侵染液浸泡处理后进行漂浮育苗。在烟苗大十字期测定浸种烟苗的病毒携带率及含量。结果表明,种子经TMV、CMV和PVY侵染液浸泡的处理烟苗均不同程度地感染了病毒病。导致烟苗带毒的侵染液最低病毒浓度(阈值)TMV为7.46×10~4copies/μL、CMV为7.44×10~4copies/μL、PVY为7.52×10~4copies/μL。烟苗携带病毒含量与侵染液的病毒浓度不相关。烟草种子表面携带病毒含量高于阈值则导致烟草苗期感染病毒病。     

两株根际促生细菌对TMV的生防作用研究

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是危害烟草的主要病毒之一,其寄主范围广、侵染力和抗逆性强,尚无有效的抗病毒药剂。利用植物根际促生细菌（PGPR）对寄主的促生以及对病毒的钝化作用进行病毒病早期预防,是控制TMV的有效途径。本文对筛选到的两株PGPR菌株Sa和Sk进行了菌株鉴定及促生和防病作用研究。结果表明:Sa为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、Sk为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。在霍格兰氏营养液中添加Sa、Sk的发酵上清液,能显著促进烟苗的根系发育和茎叶生长;“半叶法”试验结果显示Sa、Sk的发酵上清液能在体外钝化TMV,并且Sa的粗蛋白溶液、去蛋白上清、蛋白失活后的粗蛋白溶液对TMV的抑制效果分别为85.2%、83.1%、36.2%,说明Sa的发酵物中对TMV起钝化作用的活性物质主要包括蛋白和非蛋白两类;Sk的粗蛋白溶液、去蛋白上清抑制TMV的效果分别为88.0%、0%,说明Sk的发酵物中对TMV起钝化作用的活性物质主要为蛋白类。利用TMV30B侵染性克隆,观察到Sa、Sk发酵上清液能显著抑制病毒的初侵染。室内栽培烟株喷施Sa、Sk发酵上清后,对TMV的防效分别为27.71%和18.55%。芽孢杆菌Sa生防效果好于Sk,具备抗病毒剂的开发潜力。      

德阳地区晒烟病毒种类及发生规律研究

病毒病在德阳晒烟上每隔1-2年大发生一次,造成重大经济损失。1989-1991年,采用ELISA等手段,鉴定了该地区晒烟病毒标样722个。结果表明,烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯病毒Y(PVY)是晒烟上的3种主要病毒。在不同年份或同一年份的不同时期,这3种病毒发生的比例各不相同。重病年以蚜传的CMV、PVY为主。烟草病毒病流行与否与2、3月的气温及雨日关系密切。调查了该地区的毒源植物,提出了以治蚜避蚜、提高烟株抗病力为中心的综合防治措施,取得了明显的防治效果。      

烟草镰刀菌根腐病生防假单胞菌的筛选与鉴定

【背景和目的】镰刀菌引起的根腐病是烟草主要土传病害之一,为筛选对烟草镰刀菌根腐病菌具有较好抑制作用的假单胞菌。【方法】采用稀释涂布平板法从健康烟株根际土壤中分离纯化对烟草镰刀菌根腐病（Fusariumrootrot）主要病原具有一定拮抗作用的假单胞菌;采用形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定,并测定促生防病效果。【结果】（1）分离纯化的2株假单胞菌分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa YZ66和绿针假单胞菌P. chlororaphis YX33;(2)YZ66和YX33对茄病镰刀菌（F.solani）菌丝的抑制效率分别为79.66%和76.68%,对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）的抑制效率分别为79.93%和57.48%,对烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）、根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）等也有抑制效果;（3）2株菌株具有显著的促生防病作用,YZ66盆栽防病效果在81.21%以上,YX33在67.55%以上;最大叶面积、鲜重等有所增加;（4）2菌株均含吩嗪-1-羧酸（Phenazine...     

陕西烟田病害种类调查

以烟田系统调查为主要手段明确了2010-2014年陕西烟区的主要病害种类、分布及其发生程度。结果表明,危害陕西省烟田的主要病害有16种,其中烟草真菌性病害6种：烟草猝倒病、烟草赤星病、烟草根黑腐病、烟草灰霉病、烟草白粉病和烟草黑胫病;烟草细菌性病害3种：烟草青枯病、烟草野火病和烟草角斑病;病毒性病害5种：烟草黄瓜花叶病毒病（CMV）、烟草马铃薯Y病毒病（PVY）、烟草蚀纹病毒病（TEV）、烟草普通花叶病毒（TMV）、烟草脉带花叶病毒（TVBMV）;线虫病害1种：烟草南方根结线虫病;烟草非侵染性病害1种：气候性斑点病。     

烟蚜的天敌种群消长初步研究

烟蚜是危害烟草严重的害虫之一,在我省各烟区广泛分布,它不仅直接为害烟株,而且还是传播黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)等一百多种病毒的媒介昆虫,它能引起多种烟草病毒病的流行。以往防治烟蚜单纯依靠化学农药,导致烟叶中农药残留量增加,严     

微生物菌剂对烟草根结线虫及根际微生物群落多样性的影响

为寻找对烟草根结线虫病有良好控制效果的药剂,探究药剂施用对烟草根际土壤微生物群落的代谢情况,改善土壤微生态环境,以烟草品种红花大金元为试验材料,通过田间试验研究施用枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉、荧光假单胞杆菌、哈茨木霉和阿维菌素、阿维·丁硫对烟草根结线虫病病害控制、根际土壤微生物群落多样性变化及烟草生长的影响。结果表明,淡紫拟青霉、荧光假单胞杆菌能够分别达到89%、76%的防治效果。AWCD值、McIntosh指数、Simpson指数均显示土壤中增施微生物菌剂能够提高根际土壤微生物群落代谢能力,促进土壤微生物群落对碳源的整体利用,增强代谢活性。Pearson相关分析表明,根际土壤中微生物群落对31种碳源的代谢利用与病情指数呈负相关。土壤中添加微生物菌剂淡紫拟青霉、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌均能够控制烟草根结线虫病,增强土壤微生物群落多样性,促进烟株生长,淡紫拟青霉效果最好。淡紫拟青霉处理后通过提高根际土壤微生物对碳水化合物类（D-半乳糖酸-γ-内酯）碳源的代谢利用,达到对病情指数的有效调控。淡紫拟青霉处理除最大叶长外,株高、茎围、有效叶片数、最大叶宽均为最大增幅分别为44.91%、20.11%、11.78%、39.05%。     

烟草黄瓜花叶病毒抗性位点发掘

烟草黄瓜花叶病毒（CMV）是烟草生产中主要病害之一,发掘其抗性位点,培育抗病品种是最有效的策略之一。本研究利用高抗CMV烤烟品种台烟8号为轮回亲本,优质感病烤烟品种NC82为供体亲本,配置BC1F1群体。在此基础上,利用组织快繁技术对200份BC1F1群体进行快繁,苗期人工接种CMV,获得稳定、可靠的表型数据。利用SSR标记构建遗传图谱,进而利用单向方差分析和完备复合区间作图法发掘CMV抗性位点。结果表明,单向方差分析法分别检测到5个与发病率性状和病情指数性状相关的标记;完备复合区间法共定位到5个QTL,其中2个与发病率性状相关,3个与病情指数性状相关。相关定位结果对开展分子育种辅助改良烟草CMV抗性具有一定意义。     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

生防真菌与氨基寡糖素组合对烟草黑胫病和根黑腐病的防治

针对烟草黑胫病和根黑腐病两种烟草土传病害日益加重的现状,利用生防真菌棘孢木霉MX菌株和产紫青霉Q2菌株分别与植物诱抗剂氨基寡糖素进行组合,在盆栽条件下测定了其分别在两种病害胁迫下的抗病效果。结果表明,产紫青霉Q2和棘孢木霉MX对烟草黑胫病菌和根黑腐病菌均有较强的拮抗作用,其发酵滤液能有效抑制两种病原菌的生长,与氨基寡糖素组合后能够更好地促进烟草幼苗的生长,对黑胫病和根黑腐病的防治效果均达到65%以上,能显著提高发病烟草中防御酶PAL、SOD、POD的活性。     

马里兰烟病毒病症状类型、毒源种类及病毒侵染构型研究

湖北五峰县是中国唯一的马里兰烟种植区。2011年在湖北马里兰烟产区进行病毒病发生情况大田调查,发现主要有花叶、畸形、脉坏死、蚀刻等4种症状类型,幵采用指示植物法对主要症状类型所含病毒的种类进行了鉴定;对采集的57份病毒病样本采用DAS-ELISA进行病毒种类的鉴定。结果表明,发生在马里兰烟上的烟草病毒种类包括TMV、CMV、PVX、PVY 和 TEV,TMV 检出率最高,PVY 次之;以2种或2种以上病毒复合侵染方式为主,其中 TMV＋PVY、TMV＋CMV＋PVY共存方式较为常见。     

河南烟草主要病毒发生种类及侵染类型分析

为进一步明确河南烟区主要病毒种类及侵染类型,2020年从河南9个烟区分别采集疑似烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草蚀纹病毒(TEV)侵染的烟草样本共407份,分别利用上述4种病毒的特异性引物进行单重RT-PCR病原检测。检测结果表明,河南烟区病毒病样本的总检出率为98.28%,其中,检出率最高的是CMV为89.19%,其余依次为TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。侵染类型分为单一病毒侵染和复合病毒侵染,单一病毒侵染率为23.34%,该侵染类型中CMV所占比例最高,为16.71%;复合病毒侵染率为74.94%,复合病毒侵染类型中CMV+TMV所占比例最高,为36.86%,其次分别为CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY两种侵染类型,侵染比例均是7.62%。因此,CMV是2020年河南烟区的优势病毒,田间侵染以复合病毒侵染为主,侵染类型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY。     

重庆丰都烟区田间烟草病毒病及其Dot-ELISA检测

为明确重庆市丰都烟区田间烟草病毒病的发生情况,开展了病毒病调查,并于还苗期、伸根期、旺长期和成熟期共采集病毒病样品117份,利用TMV、CMV、PVY、TEV、PVX、TuMV和BBWV-2等7种病毒的特异性抗体对其进行Dot-ELISA检测。调查发现,病毒病症状主要包括花叶、畸形、坏死斑、脉坏死、矮化和蚀纹等类型。9个调查点烟草病毒病的发病率在28%~84%,病情指数最低为6.67,最高为60.89。Dot-ELISA检测结果表明,还苗期样品未检出病毒;伸根期没有检测到PVX;旺长期和成熟期均检测到7种病毒,其中TMV和CMV的检出率较高,其次为TuMV和PVY,PVX的检出率较低。此结果表明,烟草病毒病在丰都烟区发生较普遍,且TMV和CMV为田间烟草病毒病的优势毒源。     

Innovative Methods for Removal of PCR Inhibitors for Quantitative Detection of Plesiomonas shigelloides in Oysters by Real-Time PCR

A quantitative assay for Plesiomonas shigelloides in pure culture and oysters based on the real-time polymerase chain reaction (Rti-PCR) was developed. The methodology involved the treatment of oyster tissue homogenates with formaldehyde, differential centrifugation, and treatment of samples with activated charcoal coated with Pseudomonas fluorescens. With seeded oyster tissue homogenates, without formaldehyde or coated charcoal treatments, the lowest level of detection for P. shigelloides was 1 × 10⁷ genomic targets per gram of tissue, equivalent to 2.5 × 10⁵ genomic targets per Rti-PCR. The addition of 4% formaldehyde to tissue homogenates reduced the minimum level of detection of P. shigelloides to 1 × 10⁵ genomic targets per gram of tissue, equivalent to 2.5 × 10³ genomic targets per real-time PCR. The treatment of tissue homogenates with only activated charcoal coated with P. fluorescens reduced the minimum level of detection of P. shigelloides to 1 × 10⁴ genomic targets per gram, equivalent to 2.5 × 10² genomic targets per real-time PCR, without DNA purification or enrichment. The combination of adding 4.0% formaldehyde to oyster tissue homogenates and treating with coated charcoal reduced the level of detection of P. shigelloides to 1 × 10³ genomic targets per gram, equivalent to 25 genomic targets per real-time PCR. The linear range of detection was from 1 × 10³ to 1 × 10⁶ genomic targets per gram without enrichment.     

不同真菌菌剂对烟草病毒病的田间防治效果

真菌激发子能诱导植物产生系统抗性,表现出抗植物病毒的作用。对西瓜枯萎菌、苹果轮纹菌、小麦赤霉,以及土壤真菌ESF-6菌株、XFPF-6菌株、C1菌株、XFSF-8菌株、疫霉等8种真菌菌剂的抗病毒活性进行了研究。用不同真菌发酵液喷雾处理田间烟草植株叶片,检测真菌菌剂对烟草病毒病的防治效果。结果表明,8种真菌菌剂对烟草病毒病均有一定的防治效果,其中ESF-6菌剂防效最高,发病高峰期的防效为83.8%。在烟草整个生长期真菌XFPF-6的防效较为稳定,防效稳定在60%以上。小麦赤霉菌,苹果轮纹菌的防效也较高,分别为64.8%,73.7%。除C1菌剂外,其他7种真菌菌剂的防效均高于盐酸吗啉胍,可开发为真菌抗病毒菌剂。经18s rRNA序列测定和显微形态观察鉴定ESF-6为曲霉(Aspergillus sp.),XFSF-8为青霉(Penicillium sp.)。