基于实时荧光PCR的鹅鸭混合绒定量检测

传统的羽绒品种定量检测方法为显微镜检测法,费时长且依赖检测人员的经验。本研究建立了基于实时荧光PCR技术的鹅鸭混合绒定量检测方法。通过设计针对鹅、鸭线粒体DNA序列的特异性引物和Taq Man探针,且两组引物探针具有几近相同的扩增效率,建立羽绒品种检测的定量标准曲线(R20.99)。以不同产地的鹅鸭混合绒验证该方法,均得到较好结果,证明线粒体拷贝数对定量结果基本没有影响。该方法有望用于羽绒品种的大批量快速定量检测。     

肉制品中猪源性成分相对定量检测方法研究

目的建立一种肉制品中猪源性成分的相对定量检测方法。方法针对猪的ER-beta基因的mRNA序列设计了特异性引物与探针序列,并对引物和探针的特异性进行了验证。构建重组质粒,利用质粒拷贝数的log值和Ct值构建标准曲线。通过标准曲线计算各个样本拷贝数,将待测样本和标准种源样本的拷贝数进行比较,确定检测样本的猪源性含量。结果实际掺加量分别为20%、40%、50%和60%的混合样品经该方法检测所得掺假量均值为猪体系24.8%、53.1%、53.1%、61%,检测结果与其实际含量基本一致。结论该方法基本能实现肉制品中猪源性成分的相对定量检测。     

产黄曲霉毒素真菌双重荧光定量PCR检测技术的建立与应用

为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR引物探针和nor-1引物探针,随后建立并优化双重荧光定量PCR的反应条件,构建标准曲线,测定该方法的重复性、灵敏度和特异性。结果显示,成功筛选出aflR-2和nor1-2 2组引物/探针组合,并优化和确定了引物/探针的最佳反应终浓度。特异性实验结果显示,本研究建立的检测方法仅对产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因呈现特异性扩增,对黑曲霉、碳黑曲霉、赭曲霉和镰刀菌等常见产毒真菌的核酸样品均无扩增曲线。建立的方法重复性好,批内和批间变异系数均<3%,双重反应体系的检测灵敏度均低至1×10² copies/μL。利用本研究所建立的方法与ELISA试剂盒分别对80份食品样品进行检测,结果显示,双重荧光定量PCR共检测出9份阳性样品,而ELISA试剂盒只检测出了7份阳性,表明本研究建立的方法具有更高的灵敏度和准确性。     

基于便携式荧光定量PCR仪定量检测驴肉中掺假鸭肉

为建立快速方便的驴肉制品分子鉴定方法,本文以驴肉和常见的掺假肉类(鸭肉)为研究对象,筛选特异性引物和TaqMan探针,利用便携式Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪进行灵敏度和特异性实验,通过绘制扩增标准曲线及确定驴肉和鸭肉的质量与DNA比值常数,对不同掺入比例(加入定量的鸭肉制成含量分别为20%、40%、60%、80%)的模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法对驴、鸭肉均具有良好的特异性,可以与马、猪、山羊、梅花鹿、牛、鸡、狗肉明显区分;对驴源性DNA成分的检出限为0.01 ng/μL,鸭源性DNA成分的检出限为0.1 ng/μL,对驴肉与鸭肉混合物中鸭肉成分的灵敏度为0.1%(w/w);所建立的标准曲线线性关系良好,驴肉DNA扩增标准曲线:y=-3.584x+27.003,R²=0.9982;鸭肉DNA扩增标准曲线:y=-3.538x+30.907,R²=0.9991;采用已建立的方法对35份驴肉样本进行市场试点调查,发现6份(17.1%)驴肉样本中含有鸭肉成分。以上研究结果说明,该实时荧光定量PCR方法可用于驴肉产品中其他...     

实时荧光PCR定量测定肉制品中羊源性成分

为准确定量肉制品中羊源性成分的含量,以羊单拷贝基因为扩增靶基因,设计合成羊源的引物、探针,制备羊源和脊椎动物通用基因的重组质粒以构建标准曲线,通过方程算出各自的拷贝数,根据拷贝数的比值计算样品中羊肉源成分占总肉成分的百分比含量,建立荧光定量PCR检测体系,并对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和灵敏度,最低检测到羊的DNA含量为0.02 ng/μL。对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测发现,羊肉掺入量为90%、50%时所得结果相对准确,相对标准偏差分别为5.69%和10.82%, 且不受外源物种的干扰。本试验建立的定量PCR方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现存在掺假现象。     

烟叶原料对卷烟主流烟气水分的影响

为了解烟叶原料对卷烟主流烟气水分的影响,对云南不同地区生产的98个不同等级的K326、红花大金元、云烟85和V2烟叶样品的总糖、还原糖、总氮、钾离子、氯离子和主流烟气水分的检测数据进行了统计分析。结果表明:①K326、红花大金元、云烟85烟叶主流烟气水分差异不大,平均为3.7 mg/支,V2品种烟叶主流烟气水分平均为2.5 mg支/;②同一品种,上部烟叶主流烟气水分中部烟叶下部烟叶;③同一品种不同产地烟叶主流烟气水分有一定差异,但差异小于部位,尤其是上、中部与下部;④主流烟气水分与烟叶的总糖、还原糖、钾离子负相关,与总氮正相关,与氯离子不相关。     

基于Real-time PCR法检测乳粉中牛源性成分定量研究

基于Real-timePCR建立了乳粉中牛源性成分相对定量检测方法,并对牛的特异性引物与探针进行了特异性、灵敏度和稳定性测试。通过模拟不同浓度牛乳粉与马乳粉混合样本,根据其△Ct值的函数关系进行线性拟合进而绘制标准曲线,建立乳粉中牛源性成分的相对定量检测。结果显示,该方法的最低检测限为0.000 01 mg/mL,回收率为91.11%～119.2%,组间变异系数≤0.58%、组内变异系数≤1.44%。说明该方法在特异性与稳定性上适用于乳粉中牛源性成分及含量的掺假检测。     

烟草赤星病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

为实现对烟草叶片中烟草赤星病菌的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR(q-PCR)快速检测,根据链格孢属ITS基因序列差异位点,设计了1对特异性引物.通过构建含有目的片段的重组质粒,建立了标准曲线,构建了q-PCR快速定量检测方法并对感病叶片进行检测,灵敏度达到1.0×10-3 ng/μL.实验样品验证表明,该方法可...     

云南“红花大金元”品种巨型变异株系的发现和研究

2008年12月18-19日,由云南省烟草公司科技处,云南中烟工业公司科技开发部,红云红河集团、红塔集团、云南烟草科学研究院及云南省烟叶公司相关专家,对昆明市2008年田间种植试验的"变异巨型红花大金元"烟叶样品进行感官质量评价。结果是:1."变异巨型红花大金元"烟叶与对照常规"红花大金元"烟叶对比,总体上感官质量接近;2."变异巨型红花大     

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。     

肉制品中羊源性成分的定性和定量检测

通过检测肉制品中DNA的来源进行动物源性检测是打击鲜肉及加工肉制品制假掺假的重要技术手段。依据GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法》合成用于TaqMan 实时荧光聚合酶链式反应的引物和探针,利用鲜肉及加工肉制品进行羊源性成分定性和定量检测方法研究。首先利用12 种不同动物鲜肉组织的DNA检测方法的特异性,然后以羊源DNA梯度稀释液为模板进行灵敏度实验,最后在加工肉制品中检测方法的适用性和定量检测能力。结果表明：此方法具有羊源性成分检测特异性,对其他动物来源的鲜肉DNA均无扩增信号,可以检出羊肉和猪肉混合样品中0.1%的羊肉;方法灵敏度高,可以检出10 pg的羊源DNA;方法适用性广,可以对加工肉制品（羊肉干）进行羊源性成分的定性和定量检测。     

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。     

转基因棉花MON88913转化体特异性定性、定量PCR检测方法

本文以我国批准商业化的转基因耐草甘膦棉花MON88913为研究对象,建立并验证了其转化体特异性定性、定量PCR检测方法.建立的定性PCR方法的检测极限是20个拷贝棉花单倍体基因组DNA,定量PCR方法的检测和定量极限分别是10和20个拷贝棉花单倍体基因组DNA.同时,我们组织了实验室5位研究人员对建立的定量PCR检测方法进行了协同验证.对5个盲样的定量分析结果显示与真实值的偏差介于1.59% 和10.12%之间,完全满足国际标准25%偏差范围的要求,完全可用于转基因棉花MON88913的实际样品检测.     

烟草拟茎点霉快速检测方法的建立

为实现烟草拟茎点霉的快速准确检测,利用真菌rDNA-ITS通用引物对拟茎点霉和其他10种烟草病原菌基因组DNA进行了PCR扩增、片段回收及DNA测序,在序列比对基础上设计了两对特异性检测引物,并鉴定了引物的检测灵敏度和特异性,同时优化建立了PCR反应体系。结果表明,在退火温度为60 ℃时,两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R从烟草拟茎点霉DNA样本中分别扩增出来420 bp和381 bp的特异性条带,而在其他10种烟草病原菌DNA以及阴性对照中均不能扩增到任何条带。两对特异性引物的检测灵敏度均达到10 pg/μL。建立的基于两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R的分子检测方法可实现对病原菌烟草拟茎点霉的快速准确检测。      

Standard and Light-Cycler PCR methods for animal DNA species detection in animal feedstuffs

In this work four species-specific primers and probes were designed and evaluated for the detection and quantification of bovine, ovine, swine and chicken mitochondrial DNA in feeds. PCR primers were optimized using conventional and Real Time PCR, to detect short species-specific sequences amplifiable from heat treated material. Both methods confirmed the high specificity of the primers designed. Real time quantitative PCR assay allowed the detection of as few as 0.01 ng and 0.05 ng of ovine and bovine genomic DNA, respectively. The detection limit for swine and chicken genomic DNA was 0.5 ng. Sensitivity levels observed in DNA extracted from meat samples processed according to EU legislation were different compared to those in genomic DNAs previously described. They resulted in swine 5 fg of MBM DNA, in chicken 25 ng, in ovine and bovine 50 ng. We confirmed the efficiency and specificity of primers in RT-PCR to detect 0.5% of bovine, ovine, swine and chicken MBM in contaminated feedstuffs.Industrial relevanceThe variant Creutzfeldt Jakob disease is a rare and fatal human neurodegenerative condition clearly linked with the bovine spongiform encephalopathies (BSE) of cattle. The ban of using animal derived protein in animal feeds has efficiently controlled the development of the BSE epidemic. The work presented by Frezza and collaborators is an application of the real time polymerase chain reaction (a standard procedure used in molecular biology also known as RT‐PCR) to identify specific DNA of four animal species (bovine, ovine, swine and chicken). This method is applied to the analysis of feeds to detect and eventually estimate the amount of animal derived proteins. The difficult aim to detect DNA derived from heat‐treated material was successfully reached using as target short mitochondrial DNA sequences. The method presented could have important application not only in the control of feed production but also in many fields of the food industry as quality and process control.     

食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR的快速检测

本文运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中常见的乳酸杆菌进行检测的快速方法.针对乳酸杆菌16S rDNA序列,设计了通用引物和特异性探针,进行TaqManTM实时PCR检测,以非同源性参考菌株做特异性检测;把乳酸杆菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.实验结果表明用实时荧光PCR法检测乳酸杆菌,快速、敏感、特异性高.     

双重实时荧光定量PCR检测转基因植物常用调控元件的适用性研究

目的 建立一种双重实时荧光PCR检测转基因植物中常用调控元件pCaMV35S和tNOS的方法。方法 首先, 通过扩增多个植物DNA来测定此系统的特异性; 然后, 将转基因棉花的模板DNA稀释5个梯度, 检测此方法检出限(Limit of detection, LOD), 建立标准曲线判断该方法的定量能力; 最后, 通过相对模拟掺假试验测定此灵敏度。结果 特异性试验的检测结果显示此系统具备较强的特异性, 能够区分含有上述两种调控元件的转基因植物和非转基因植物。此方法对于pCaMV35S基因的检测限为1 ng, 对于tNOS 基因的检测限为10 ng。依托此方法建立的标准曲线的扩增效率分别为96%和87%, R2均大于0.99, 方法具有定量能力。而且, 方法的相对灵敏度达到1%, 满足混合样品中转基因成分的检测要求。结论 建立的双重实时荧光PCR方法表现出较强的特异性和较高的灵敏度, 有高通量、低成本以及定量检测的能力。