手性拆分异丙甲草胺中间体的产脂肪酶菌株的筛选及优化

[目的]从土壤中筛选出能选择性水解2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙甲酯(NEMPAME)的菌株,并对该菌株进行鉴定及优化。[方法]以NEMPAME为碳源,结合传统的罗丹明B平板筛选方法,通过摇瓶复筛,筛选1株具有最高立体选择性水解NEMPAME的菌株。在摇瓶培养下,采用单因素和正交试验,对其培养条件进行优化。[结果]从土壤中筛选出1株催化拆分NEMPAME的菌株,经形态观察和16Sr RNA鉴定,初步认为是铜绿假单胞菌(Pseudomonas)。经培养条件优化后酶活提高了308.98%。[结论]该菌株拆分NEMPAME研究中发现,活性蛋白属于胞内酶,手性选择性为R-型。优化后:葡萄糖10 g/L,酵母20 g/L,Mg SO40.5 g/L,Zn Cl20.5 g/L,橄榄油10 g/L,初始p H值7.5,培养温度37℃,发酵时间48 h。     

棘白霉素B脱酰基酶产生菌转化条件的优化研究

为提高棘白霉素B脱酰基酶产生菌的转化率,通过紫外诱变复合Cu2+抗性处理筛选转化高产菌种,利用均匀设计方法优化菌种的转化工艺。结果表明,筛选得到的突变株132#的棘白霉素B转化率比出发菌株提高了22.6%,优化后的转化条件为:底物浓度2 400μg·mL-1,转化时间56h,转化温度30℃,发酵培养基pH值6.0。132#菌株在优化转化条件下的转化率较出发菌株在原始转化条件下提高了57.3%。优化的转化条件更有利于高产菌株的转化,转化率得到大幅提高,也为其工业化应用打下基础。     

一株产腈水合酶菌株酶活高效表达条件的研究

以抚顺腈纶厂废水中筛选的一株Nocardia sp为出发菌株,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的体积浓度重复继代培养,得到1株酶活高效表达的Nocardia sp菌,酶活比出发菌株提高了15倍。确定了菌株培养的最优条件:葡萄糖(25 g/L),诱导剂脲(0.06 g/L)、Co2+(0.02 g/L)、丙烯酰胺(10%),反应条件pH(7)、温度(20℃),底物丙烯腈体积分数(<5%),产物丙烯酰胺的质量分数(<20%)。正交实验表明,反应温度和脲的加入量为反应过程中的显著因素。     

产纤维素酶增效蛋白菌株的筛选及培养条件优化

为了寻找高效的产纤维素酶增效蛋白菌株,建立一种筛选方法从土壤中筛选得到一株产纤维素酶增效蛋白的细菌POEP1,其所产增效蛋白对纤维素酶(来源于黑曲霉Aspergillus niger)的滤纸酶活有明显的增效作用,通过对其进行16SrDNA分类鉴定,确定该菌株为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)。为进一步提高POEP1产纤维素酶增效蛋白的水平,对其培养条件进行优化。采用单因子试验筛选出最佳碳源为麦麸,最佳氮源为黄豆粉。再通过Plackett-Burman设计对与发酵相关的11个因子进行试验,筛选出麦麸、黄豆粉和KH2PO4为3个主要显著因子;由Box-Behnken实验结合响应面分析确定主要因子的最优水平为:麦麸质量浓度32.3 g L 1,黄豆粉质量浓度24.7 g L 1,KH2PO4质量浓度4.36 g L 1。优化后纤维素酶增效蛋白的产量提高1.7倍,增效活力由15.79 U mL 1增至43.31 U mL 1。     

N~＋注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究

应用低能氮离子（N＋）注入技术对纤维素酶产生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）进行诱变选育,在能量为10 keV,注量为150×10^14和200×10^14N＋/cm^2的条件下分别筛选得到3株纤维素酶高产菌株,连续5代遗传稳定性实验结果表明,所得到的高产菌株遗传稳定性较好,羧甲基纤维素酶活力均提高到3.300 IU/mL以上,较出发菌株（2.698 IU/mL）提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman实验设计法和旋转中心组合设计法系统地研究高产菌株150-1-1发酵营养因子组成,得到了纤维素酶产量随葡萄糖、麸皮和微晶纤维素等营养因子的变化规律及相应的响应面分析图。实验结果表明,葡萄糖、麸皮和微晶纤维素浓度与纤维素酶活存在显著的相关性,当葡萄糖浓度为4.9 g/L,麸皮浓度为23.0 g/L,微晶纤维素浓度为7.7 g/L时,150-1-1纤维素酶滤纸酶活力达到2.439 IU/mL,较优化前（2.000 IU/mL）提高了22.0%。     

石油污染土壤中石油降解菌的筛选及降解特性研究

从辽河油田石油污染土壤中采取土样,经过富集分离筛选后得到单一的石油降解菌株,命名为G1。通过对菌株形态特征和生理生化特性的分析,初步鉴定为芽孢杆菌属,对原油的降解率为21%。对G1菌株的降解条件进行优化,通过正交实验得到最佳降解条件为:N源为(NH4)2SO4,P源为K2HPO4,pH为8,接种量为3 ml,原油浓度为0.2%,对最优组合进行实验验证得到原油的降解率达到45%。     

生物催化肉桂醇制备3-苯丙醇

筛选到能催化肉桂醇生成3-苯丙醇的菌株CG10,该菌株被鉴定为毛霉菌(Mucor sp.)。对其进行生物催化研究,用气相色谱-质谱联用仪、红外光谱仪、高效液相色谱仪对产物进行了表征。通过对微生物催化反应条件的优化及对底物的耐受性实验得到最优降解条件为:糊精质量浓度为3g/L,蛋白胨质量浓度为1.6g/L,反应体系初始pH=5,肉桂醇的初始加入量为2mL/L,30℃下反应24h,二次加入量为0.5mL/L,反应8h,3次加入量为0.5mL/L,反应16h。在此条件下肉桂醇的转化率为99%,3-苯丙醇的选择性为92%,转化液中3-苯丙醇的产量较优化前提高了123%,达到2.9g/L。     

N+注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究

应用低能氮离子（N⁺）注入技术对纤维素酶产生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）进行诱变选育,在能量为 10 keV,注量为150×10¹⁴和200×10¹⁴ N⁺/cm²的条件下分别筛选得到3株纤维素酶高产菌株,连续5代遗传稳定性实验结果表明,所得到的高产菌株遗传稳定性较好,羧甲基纤维素酶活力均提高到3.300 IU/mL 以上,较出发菌株 （2.698 IU/mL） 提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman实验设计法和旋转中心组合设计法系统地研究高产菌株 150-1-1 发酵营养因子组成,得到了纤维素酶产量随葡萄糖、麸皮和微晶纤维素等营养因子的变化规律及相应的响应面分析图。实验结果表明,葡萄糖、麸皮和微晶纤维素浓度与纤维素酶活存在显著的相关性,当葡萄糖浓度为4.9 g/L,麸皮浓度为23.0 g/L,微晶纤维素浓度为7.7 g/L时,150-1-1纤维素酶滤纸酶活力达到2.439 IU/mL,较优化前 （2.000 IU/mL） 提高了22.0%。     

头孢菌素C产生菌的诱变育种及发酵应用

以头孢菌素C产生菌顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)B-1822-S-04为出发菌株,经过紫外线和丙二酸复合诱变,筛选得到了4株头孢菌素C高产菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133,其中菌株D-G-096的效价高达6 816 mg·L~(-1),较出发菌株提高了50.80%,且高产特性稳定;50 L发酵罐小试结果显示,菌株D-G-096的效价达到了29 270 mg·L~(-1),较出发菌株提高了111.06%,可作为优良高产菌株保存使用。该实验筛选出的高产菌株及其在小试中的应用,可为后期工业化生产提供优质菌种资源,为发酵工艺提供指导。     

微生物燃料电池中Tolumonas Osonensis菌株的产电性能优化

以课题组前期筛选得到的菌株Tolumonas osonensis P2-A-1为对象,通过菌体初始浓度、底物种类和浓度、阳极液p H、外电阻等参数的优化以及细胞的通透化处理,提高其在微生物燃料电池中的产电性能。结果表明,菌株T.osonensis P2-A-1接种到TSB液体培养基中,22℃有氧条件下静置培养48 h(OD600=2.714),离心收集的菌体经1mmol?L?1 EDTA处理20 min后,接种到阳极液Ⅱ(PBBM液体培养基中加入终浓度为2.000 g?L?1的乙酸钠(作为底物)和终浓度为5.000 g?L?1的柠檬酸铁,p H 7.2),制备得到细胞浓度为3.394 g?L?1的接种液,注入MFCs反应器,外接1000?电阻,于室温下运行14 d,功率密度达到509 m W?m?2,比优化前提高了162.4%。这是首次对T.osonensisa种内微生物产电性能及其在微生物燃料电池中应用的报道。其成果对于丰富产电微生物的多样性,挖掘更多具有高电化学活性的微生物纯种、提高其产电性能具有重要的指导意义。     

固定化啤酒酵母对锶离子的吸附

用2%海藻酸钠(SA),4%氯化钙(CaCl2)包埋法制备了固定啤酒废酵母。考察了菌体含量对固定化菌体强度的影响,研究了pH值、温度、Sr2+初始浓度、吸附时间等外界因素对固定化啤酒酵母吸附溶液中Sr2+的影响。结果表明:菌体含量为10%时,制备的固定化菌体具有较好的机械强度。固定化啤酒废酵母对Sr2+最佳吸附条件为:pH=4.5,温度30℃,Sr2+起始浓度50 mg/L,吸附时间4 h。Sr2+浓度在10～150 mg/L范围内,固定化啤酒废酵母对Sr2+的吸附符合Langmuir模型和Freundlich模型,但符合Freundlich模型的程度更优。     

Synthetic Saccharomyces cerevisiae‐Shewanella oneidensis consortium enables glucose‐fed high‐performance microbial fuel cell

Microbial fuel cells (MFCs) were green and sustainable bio‐electrochemical reactors for simultaneous wastewater treatment and electricity harvest from organic wastes. However, exoelectrogens, such as Shewanella and Geobacter being widely studied in MFCs, could only use a limited spectrum of carbon sources. To expand the carbon source range being used in MFCs, we herein rationally designed a glucose‐fed fungus‐bacteria microbial consortium including a fermenter (Saccharomyces cerevisiae) in which the ethanol pathway was knocked out and the lactic acid biosynthesis pathway from Bovin was introduced into S. cerevisiae, and an exoelectrogen (Shewanella oneidensis MR‐1). We optimized the co‐culturing conditions of the microbial consortium to achieve an optimal coordination between carbon source metabolism of the fermenter and extracellular electron transfer of the exoelectrogen, such that lactate, the metabolic product of glucose by the recombinant S. cerevisiae, was continuously supplied to S. oneidensis in a constant level until glucose exhaustion. This metabolic coordination between the fermenter and the exoelectrogen enabled bioelectricity production in a glucose‐fed MFC. Furthermore, a porin protein encoded by oprF gene from Pseudomonas aeruginosa was incorporated into the outer membrane of S. oneidensis to enhance membrane permeability and its hydrophobicity, which in turn facilitated its biofilm formation and power generation. The glucose‐fed MFC inoculated with the recombinant S. cerevisiae‐recombinant S. oneidensis generated a maximum power density of 123.4 mW/m², significantly higher than that of recombinant S. cerevisiae‐wild‐type S. oneidensis (71.5 mW/m²). Our design strategy of synthetic microbial consortia was highly scalable to empower the possibility of a wide range of carbon sources being used in MFCs, e.g., xylose, cellulosic biomass, and recalcitrant wastes. © 2016 American Institute of Chemical Engineers AIChE J, 63: 1830–1838, 2017     

不同非氧化磷酸戊糖途径基因的过表达对酿酒酵母木糖发酵性能的影响

以双拷贝过表达木糖代谢上游途径关键酶(木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH和木酮糖激酶XKS)的酿酒酵母菌株为背景,在过表达非氧化磷酸戊糖(PP)途径中转醛酶基因TAL1的基础上,对途径中其他基因TKL1(转酮酶)、RPE1(核酮糖-5-磷酸差向异构酶)和RKI1(核酮糖-5-磷酸异构酶)进行了不同程度的过表达,以研究PP途径基因过表达对酿酒酵母木糖代谢的影响。在不同培养基条件下对重组菌株木糖代谢进行研究,结果显示,在过表达TAL1的基础上不同组合过表达PP途径其他基因不同程度改善了酿酒酵母木糖发酵性能,重组菌株能在36~48 h耗完质量分数(下同)为5%的木糖。其中,过表达PP途径全部基因比其他过表达基因组合表现出明显的优势,在8%木糖发酵条件下其乙醇产量达到了每1 g木糖0.337 g,较对照菌株提高了7.86%。这说明同步过表达PP途径基因更有利于酿酒酵母木糖发酵。     

耐高温产乙醇酿酒酵母菌S-13的特性研究

以耐高温产乙醇酿酒酵母菌S-13为出发菌株,在优化的培养条件下,通过连续传代转接实验对其性能进行研究。结果表明,菌株S-13种子液的最佳培养时间为12～14 h,最佳发酵时间为48 h;其遗传稳定性在20代之内相对较好,每相邻2代的乙醇浓度相对误差小于5％;对乙醇的耐受能力为14％(体积分数);热致死温度为66～67℃...     

培养条件对产朊假丝酵母合成谷胱甘肽的影响

考察了培养基组成,培养条件对产朊假丝酵母生长和谷胱甘肽合成的影响,包括不同碳源,氮源及其浓度,pH,装液量,接种量等。确定以葡萄糖、磷酸氢二铵作为碳源和氮源,较佳浓度分别为20g/L和3g/L,接种量为10％,在20 g/L 的糖 浓度时获得的谷胱甘肽总量可达74mg/L,胞内含量为1.4％左右。此外还研究了三种前体氨基酸和ATP的加入量,加入时间对发酵的影响。     

Reconstruction of tyrosol synthetic pathways in Escherichia coli

Tyrosol is a pharmacologically active phenolic compound widely used in the medicine and chemical industries. Traditional methods of plant extraction are complicated and chemical synthesis of tyrosol is not commercially viable. In this study, a recombinant Escherichia coli strain was constructed by overexpressing the phenylpyruvate decarboxylase ARO10 from Saccharomyces cerevisiae, which could produce tyrosol from glucose. Furthermore, genes encoding key enzymes from the competing phenylalanine and tyrosine synthesis pathways and the repression protein TyrR were eliminated, and the resulting engineered strain generated 3.57 mmol·L^-1 tyrosol from glucose. More significantly, codon optimization of ARO10 increased expression and tyrosol titer. Using the novel engineered strain expressing codon-optimized AR10 in shake-flask culture, 8.72 mmol·L^-1 tyrosol was obtained after 48 h. Optimization of the induction conditions improved tyrosol production to 9.53 mmol·L^-1 (1316.3 mg·L^-1). A higher titer of tyrosol was achieved by reconstruction of tyrosol synthetic pathway in E. coli.     

Overexpression of ethionine resistance gene for maximized production of S-adenosylmethionine in Saccharomyces cerevisiae sake kyokai No. 6

In our previous work, we developed an auxotrophic mutant of Saccharomyces cerevisiae sake kyokai No. 6 strain for the selection of recombinant DNA. Sake yeast can accumulate high amount of S-adenosylmethionine (SAM) that is effective for treating depression, Alzheimer’s disease and so on. In this work, we further introduced SAM2 gene and ERC1, a frame-shift mutant of YHR032w, to maximize the production of S-adenosylmethionine in S. cerevisiae sake K6. The recombinant strain accumulated SAM about half of its dry cell weight.     

灵芝提取液的发酵优化及保湿性能评价

以灵芝提取液为原料,在纳豆芽孢杆菌、酿酒酵母菌和开菲尔菌这3种菌株中筛选出适宜的发酵菌株,结果发现选择纳豆芽孢杆菌作为菌种较为合适。以保湿率为评价指标,通过单因素及正交试验对灵芝提取液发酵工艺条件进行了优化。实验结果表明：碳源果糖6%、氮源氯化铵8.5%、接种量12%、发酵温度31℃、发酵周期32 h为发酵的最佳工艺条件,在此条件下得到的灵芝提取发酵液8 h保湿率为11.51%,保湿能力强于阳性对照组SK-Ⅱ和10%甘油,且优于灵芝提取液和空白培养基。     

过表达谷氧还蛋白基因GRX5提高酿酒酵母乙酸耐性

利用可再生的纤维素原料生产燃料乙醇是国内外研究的热点。但纤维素原料一些预处理过程产生的乙酸对酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵产生强烈抑制,因此,提高酿酒酵母细胞的乙酸耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的重要手段。本文研究了谷氧还蛋白家族中GRX5p的编码基因的过表达对酿酒酵母在乙酸胁迫条件下细胞生长和发酵性能的影响。结果表明,过表达GRX5的重组菌株在含有5 g·L^-1乙酸的平板中生长优于对照菌株;在含有5 g·L^-1乙酸的培养基中进行乙醇发酵,过表达GRX5的重组菌株可在48 h基本消耗培养基中所有的葡萄糖,发酵周期比对照菌株缩短了12 h。过表达GRX5菌株的乙醇生产强度为0.897 g·L^-1·h^-1,比对照提高了28.5%。代谢物分析结果表明,过表达GRX5的重组菌株可产生更多的保护性物质海藻糖和甘油,有利于增强菌株胁迫耐受性。     

磷脂酶D的紫外诱变选育及发酵条件的优化

磷脂酶D在催化磷脂酰基交换反应中具有重要的应用价值。本文对产磷脂酶D野生链霉菌株进行紫外诱变,筛选得到一株产酶活力提高42.5%的变异株。通过摇瓶培养,对发酵条件进行探究。确定的最佳培养基组成为：葡萄糖10.0 g/L,牛肉膏和蛋白胨各5.0 g/L,MgSO4?7H2O 1.0 g/L,CaCl2 3.0 g/L,NaCl 2.0 g/L;表面活性剂Tween80对产酶有促进作用,其适宜浓度为0.60 g/L。在上述条件下,摇瓶发酵产酶活力达3.23 U/mL。