选择性降解木质素白腐菌筛选的研究

对国内外15种产漆酶的白腐菌进行初步筛选,从中获得7株产漆酶活性较高的菌株。经对木材降解能力的分析及在培养过程中所产各种酶酶活的测定,得到了2株产漆酶酶活高、降解木质素选择性优良的菌株,其中Flammulinavelutipes和My-1两菌株经14天液体培养,漆酶酶活高达214IU/mL和231IU/mL。杨木经其处理30天后木质素降解率达到22.67%和15.46%。     

β-1,4-葡聚糖内切酶的定向进化

根据阳性转化子在IPTG诱导下可以在LB-CMC平板上产生水解圈的原理,在初筛和摇瓶复筛的基础上,采用易错PCR法对β-1,4-葡聚糖内切酶基因进行定向进化,从阳性转化子中筛选酶活提高的突变菌株.突变酶活性是野生酶的1.32倍,催化效率约为野生酶的1.26倍.基因测序结果表明,突变酶基因DNA序列中有3个碱基发生了突变...     

N~+注入诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株及其产酶条件的优化

以筛选得到能够有效利用木糖渣作为碳源生产β-葡萄糖苷酶的菌株为目的,利用N+注入棘孢曲霉L22,筛选得到一株β-葡萄糖苷酶活提高1倍的突变株NIP35。通过单因子实验结合正交实验,对其培养基组成如碳源、氮源、表面活性剂等进行了优化,使其产酶水平最终提高了近2倍。     

重组里氏木霉粗酶液提取虎杖中白藜芦醇的研究

为从虎杖中提取白藜芦醇并同步实现高效转化,经平板初筛和48 h的试管产酶复筛,从619株里氏木霉的基因重组菌中定向筛选出3株高产β-葡萄糖苷酶的菌株(BG-2,BG-4和BG-5)。摇瓶条件下产酶48h,三者的β-葡萄糖苷酶酶活为1.75,3.50和5.71 IU×m L~(-1),分别是出发菌株的36倍、73倍和119倍。以三者的发酵粗酶液直接处理虎杖粗提物,45℃条件下反应5 h后,与出发菌株相对比,重组菌株对白藜芦醇的提取率可达14.86~16.41 mg×g~(-1),是出发菌株的2.41~2.66倍;转化率可达120.5%~138.4%,是出发菌株的6.0~6.85倍,且反应液中基本无白藜芦醇苷残留。该研究策略从根本上提高了纤维素酶法对苷元型白藜芦醇的提取效率,可推广应用于其他易糖苷化的中草药成分的提取。     

白腐菌Coriolus versicolor的培养及产漆酶条件的研究

从液体和固体两种培养体系出发,探索不同培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响。液体培养体系中,白腐菌的最佳生长和漆酶分泌条件是缓冲体系起始pH值为5.8、摇瓶转速为180r/min、装液量为100mL/500mL;在所有测试的碳源中,葡萄糖为最佳碳源,在二糖中以蔗糖为碳源,漆酶酶活相对较高,而多糖(如淀粉)不利于漆酶的生成。在所有测试的氮源中,硝酸铵和酒石酸铵组合为最佳氮源,氯化铵和尿素的效果次之,蛋白胨的效果最差。当碳源与氮源质量比(C/N)大于10∶1,即高碳低氮的培养条件有利于漆酶的生成。芳香化合物诱导剂ABTS浓度为0.5～1mmol/L时,对产漆酶的影响最明显,与限氮培养基中产酶相比可提高酶活5倍,约为230IU/mL;0.5mmol/L愈创木酚、1mmol/L阿魏酸和0.05mmol/L二甲基苯胺的添加可提高酶活约2～2.5倍;0.01mmol/L黎芦醇的添加可提高漆酶酶活约1.6倍。由于酪氨酸具有酚类化合物的特点,也可作为一种无毒的天然漆酶诱导剂。菌株漆酶活力在固体培养体系明显低于在液体培养体系。     

N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体高通量筛选方法及迭代饱和定点突变研究

利用瑞士乳杆菌来源的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(Lh. NDT)催化合成2’-脱氧胞苷的反应,建立高通量筛选突变体方法,利用微量滴定板分析快速便捷,显色反应灵敏度高,可以准确区分失活,活性增强与活性减弱的突变体,为成功筛选出高转化率突变体奠定的基础,计划通过迭代饱和定点突变构建NDT的突变体库,获得合成2’-脱氧胞高转化率的NDT突变体。     

溶氧对几种真菌漆酶发酵的影响

通过振荡和静置培养红灵(G.lucidum Karst)、日本赤芝(G.sp.)、阿魏侧耳(P.ferulae)、平菇苏研7号(P.ostreatusSY7)和平菇2106(P.ostreatus2106)5种真菌,发现发酵过程中溶氧对它们产漆酶能力影响很大。红灵和日本赤芝振荡培养的酶活分别是静置培养的12.86和3.5倍;阿魏侧耳振荡培养的酶活是静置培养的2倍;5种菌株振荡培养时以日本赤芝的酶活为最大(118.01 U/mL);平菇苏研7号静置培养时酶活是振荡培养的4.8倍;平菇2106振荡培养时酶活几乎为0,而静置培养时酶活高达113.5 U/mL。目前所研究和报道的漆酶产生菌多为需氧发酵菌,该实验发现平菇2106菌株能在静置培养(厌氧发酵)条件下高产漆酶(经发酵培养基初步优化漆酶产量可达337.31 U/mL),具有很大的应用前景。     

N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体高通量筛选方法及迭代饱和定点突变研究

利用瑞士乳杆菌来源的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(Lh. NDT)催化合成2’-脱氧胞苷的反应,建立高通量筛选突变体方法,利用微量滴定板分析快速便捷,显色反应灵敏度高,可以准确区分失活,活性增强与活性减弱的突变体,为成功筛选出高转化率突变体奠定的基础,计划通过迭代饱和定点突变构建NDT的突变体库,获得合成2’-脱氧胞高转化率的NDT突变体。     

无机盐对海洋内生拟盘多毛孢菌J63产漆酶及漆酶脱色偶氮类染料的影响

内生拟盘多毛孢菌J63(Pestalotiopsis sp.J63)是从东海的海滩滩涂中新分离出的一株真菌。研究考察了无机盐对该菌株产漆酶响,以及对漆酶催化底物和脱色偶氮类染料甲基橙的影响。结果表明添加H3BO3、SrCl2.6H2ONaF、KBr、MnCl2.4H2O和ZnSO4.7H2O对漆酶的产生有明显的促进作用,其中H3BO3的作用最明显,可使酶活增加221.8%。在漆酶催化底物反应时,除1 mmol L 1FeSO4.7H2O能够抑制漆酶酶活,其余无机盐均对酶活有促进作用。14 mmol L 1KAl(SO4)2对酶活的促进作用明显,使相对酶活达到124.9%。3 mmol L 1KBr使相对酶活达到116.7%,与其他菌株所产漆酶受到KBr抑制的特性相比具有优势。添加14 mmol L 1KAl(SO4)2和3 mmol L 1KBr后相应的脱色率分别达到了97.3%和75.6%,高于对照组64%的脱色率。同时还研究了适宜该菌株产漆酶的温度和pH,当温度为26oC,pH为6.0时酶活最高,达到3280.6 U L 1。     

高酶活性β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖

为了提高β-甘露聚糖酶的活性,本研究采用易错PCR将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1的β-甘露聚糖酶基因manBl进行分子进化,并在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中进行表达,以定向筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变体ManBl (I91N/L211I),其比酶活性为 15554.7 U/mg,是野生型ManBl的4.2倍,食品级表达的胞外酶产量达17601.3 U/mL。应用AlphaFold2对该酶的三维结构进行预测,结果表明,尽管β-甘露聚糖酶的2个位点(I91N 和 L211I)位于催化中心之外,但在很大程度上影响酶活性。β-甘露聚糖酶ManBl (I91N/L211I)水解魔芋胶产物主要由甘露六糖、甘露三糖和甘露二糖组成。该研究首次报道I91N/L211I 2个位点联合突变能够提高β-甘露聚糖酶活性；ManBl (I91N/L211I)食品级表达,为该酶绿色安全地应用奠定了基础。     

2,2-二甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注入选育及突变株产酶条件研究

离子注入技术被广泛应用于微生物的品种改良.利用N 离子注入法对本实验室筛选并保藏的产2,2-二甲基环丙腈水合酶菌种Pseudomonas sp.ZJUT0509进行选育,以提高2,2-二甲基环丙甲酰胺的产量,为进一步的手性拆分提供更多的原料.结果表明,氮离子注入诱变Pseudomonas sp.ZJUT0509的存活率曲线符合离子注入诱变的"马鞍型"特征曲线.通过离子注入获得的突变株的腈水合酶活性有显著提高,其中突变株F60-4的酶活达30.1 U·mL-1,约为原始菌株的9倍.对突变株F60-4进行产酶条件的优化考察,获得了培养条件.F60-4菌株产酶的最佳碳源是葡萄糖(2 g·L-1),最佳氮源是酵母粉(10 g·L-1),最适初始pH值为6.5,最适发酵温度为20℃,最佳诱导剂为1.0g·L-1的己内酰胺.与原始菌株Pseudomonas sp.ZJUT0509相比,突变株F60-4对有机氮源的利用率更高.最佳诱导剂由己内酰胺代替了原来的2,2-二甲基环丙甲腈,使实验操作简便.突变株F60-4的发酵周期为36 h,比原始菌株缩短了12 h.     

里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达

里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。进一步在QP4中过量表达β-葡萄糖苷酶(BGL)基因bgl1,经大量平板显色筛选获得2株BGL活力明显增强的工程菌QPB4和QPB5,其酶活分别提高10.01倍和8.26倍。利用发酵酶液对2种不同预处理的玉米芯底物进行水解糖化实验,结果显示以酸处理玉米芯为底物时QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分别提高60.98%和52.44%,而以脱木素处理玉米芯为底物时其葡萄糖得率分别提高80.01%和86.00%。研究表明改进里氏木霉高产突变株遗传转化体系可以显著促进菌株改良,提高糖化应用效果。     

Loop结构A79Y和T81Q定点突变对木聚糖酶XynASP热稳定性的影响

目的 识别溶糖曲霉(Aspergillus saccharolyticus)JOP 1030-1木聚糖酶Xyn ASP Loop结构中的热稳定性位点，提高其热稳定性。方法 利用Fireprot在线服务器预测木聚糖酶热稳定性相关氨基酸位点，在Loop结构中筛选有益突变位点。通过定点突变构建单点突变体Xyn^A79Y、Xyn^T81Q及双点突变体Xyn^LQ(A79Y/T81Q)。将重组突变质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达，利用Ni-NTA蛋白纯化试剂盒对重组木聚糖酶进行纯化，并测定酶的最适温度及热稳定性、最适pH及pH稳定性。结果 在Loop结构中筛选出有益突变位点A79Y和T81Q，纯化后的蛋白样品纯度较高。相比野生型Xyn ASP，突变体Xyn^A79Y、Xyn^T81Q及Xyn^LQ的最适温度分别提高了10、5和5℃。40℃热处理30 min，野生型Xyn ASP仅保留30.2%残余酶活力，而突变体Xyn^T81Q为3...     

生漆化学文摘

<正> 漆酶在有机溶剂中催化特性的研究Study of catalytic properties of laccase in organic solvents Pepangan,G.S.;Bagdasargan,Z.N.;et.Organ Redaktivg dlya Nauch Issled,M.1988,44—8(Russ).From Ref.zh,Khim,1989,Abstr NO17B4033只转有标题,CA112:3385Neurospora crassa 去阻抑漆酶的分离及其特性研究。Tamara,Hisashi;et.J.Bacterial,1989,101(11),6288—93(eng)来自 N.Crassa 担子菌的漆酶属于分泌酶。在植物性培养基中,这种漆酶的产生就会被抑制。但却能够经过低浓度的放线菌素诱导而产生。该担子菌突变体 lab—1的去阻抑漆酶的分离和特性在文章中进行了描述。仅管这种担子菌突变体没有受到放线菌酮的诱导,但也具有产生漆酶的能力。lah—1突变是在 nif—2和 leu—3键合基团Ⅰ而     

里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达

里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。进一步在QP4中过量表达β-葡萄糖苷酶(BGL)基因bgl1,经大量平板显色筛选获得2株BGL活力明显增强的工程菌QPB4和QPB5,其酶活分别提高10.01倍和8.26倍。利用发酵酶液对2种不同预处理的玉米芯底物进行水解糖化实验,结果显示以酸处理玉米芯为底物时QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分别提高60.98%和52.44%,而以脱木素处理玉米芯为底物时其葡萄糖得率分别提高80.01%和86.00%。研究表明改进里氏木霉高产突变株遗传转化体系可以显著促进菌株改良,提高糖化应用效果。     

5-氟尿嘧啶与甲基磺酸乙酯复合诱变选育高产弹性蛋白酶菌株

目的以弗氏链酶菌为出发菌,使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone,EMS)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)复合诱变,选育高产弹性蛋白酶突变菌株。方法用高氏培养基培养弗氏链霉菌,收集菌悬液经摇瓶发酵培养后,加入6 mg/ml 5-FU进行诱变处理,收集处理液,经10倍系列稀释(10-1~10-7)后,涂布初筛培养基平板,选取透明圈出现较早和HC(透明圈直径/菌落直径)值较大的菌株培养后,加入2%EMS,37℃分别作用0、15、30、45、60 min,涂布牛奶培养基,计数菌落数,计算菌悬液存活率,选择合适条件进行复合诱变选育高产弹性蛋白酶突变菌株,选取HC值较大的5个菌株,进行摇瓶发酵培养,采用Sacher法检测弹性蛋白酶活力。结果弗氏链霉菌菌液经0.6 mg/ml 5-FU处理后,经2%EMS作用30 min进行复合诱变,孢子存活率为16.1%;经初筛、复筛,获得高产生弹性蛋白酶菌株,酶活力达35.98 U/ml,比出发菌株提高了35.6%。结论选择5-FU浓度为0.6 mg/ml,EMS浓度为2%作用30 min时,对弗氏链酶菌进行复合诱变,其诱变效率高,可获得高酶活的突变株。     

糙皮侧耳菌漆酶的分离纯化及部分性质研究

对糙皮侧耳菌5.42产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、DEAE-Cellulose和SephadexA-50纯化,得到纯化18.1倍漆酶,得率36%,用PAGE检测为单一条带,用SDS-PAGE证明漆酶的分子量为61.4 kD,而用经过高效液相色谱分离的酶液进行质谱检测分子量为60.5 kD。该酶最适温度为40℃,最适pH为5.0。金属离子对酶活有很大的影响,其中K+、Mn2+、Cu2+有明显促进作用,Hg2+、Ag+、Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。该酶与果胶酶按比例组合在一起,对荨麻生物脱胶取得良好的脱胶效果——木质素去除率为85%。     

纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变

利用羧甲基纤维素钠为唯一碳源培养基从朽木、腐烂的竹叶与稻草中分离得到8株纤维素分解菌,测定了其产酶活性。对其中产酶活性较高的2#菌株进行紫外线诱变,进一步筛选得到突变株M10,其相对酶活较出发菌株提高了89.1%。     

β-葡萄糖苷酶的发酵工艺优化及在木糖渣酶水解中的应用

木糖渣有较高的纤维素含量,可以用作诱导产生β-葡萄糖苷酶的碳源。本文以木糖渣为诱导碳源,优化了黑曲霉发酵产β-葡萄糖苷酶的工艺。首先利用Plackett-Burman实验设计在6个因素中筛选出了影响产酶的主要因素,分别为麦麸、硫酸铵、硝酸钠。在筛选基础上,利用三因素五水平的中心组合对3个因素进行了进一步的优化,并用响应优化器得到了产酶的最佳条件麦麸、硫酸铵、硝酸钠的浓度分别为26.7g/L、10.0g/L、10.0g/L,在得到的最佳条件下,酶活可以达到15.0IU/mL。对拟合模型进行了方差分析,结果表明模型的R²值为92.12%,P值为0,模型拟合较好,可以对实验结果进行预测。以木糖渣为底物,用诱导制备的复配酶液验证了其水解效率,结果表明当里氏木霉粗酶液与黑曲霉粗酶液1：1复配时,酶水解效率为里氏木霉粗酶液的4倍。     

头孢菌素C乙酰化酶高通量筛选方法的改进

目的改进头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)乙酰化酶高通量筛选方法,获得催化活性显著提高的突变体。方法基于对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,p-DAB)与7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)的复合物在405 nm有最大吸收值的原理,采用无菌96孔深孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达,再以含溶菌酶和DNase的缓冲液进行菌体裂解,最后以96孔板进行底物的水解和反应终止,经p-DAB显色后,利用酶标仪进行产物的快速定量,以实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。结果利用改进的p-DAB比色法从先前建立的突变文库中筛选到2个在13℃下比酶活明显提高的突变子1A10和2G8,其比酶活分别为1.7和2.4 U/mg,较原酶的0.85 U/mg显著提高。在优化的筛选条件下,A405的变化能够准确反映酶活性的大小,确保了该方法筛选结果的可信度。结论改进的p-DAB比色法具有筛选快速,操作简便,筛选通量大及准确度高等优点,能够提高CPC乙酰化酶改造及筛选的效率,为低温CPC乙酰化酶的创制提供了技术支持。