输血传播病毒ORF2基因的克隆和原核表达

目的克隆输血传播病毒(TTV)兰州株ORF2的基因,并构建原核表达载体。方法通过巢式PCR,从一份兰州地区无偿献血员血清中扩增TTV病毒的ORF2基因,并克隆到pGEM-T载体中,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆到高效表达质粒pET22b(+)中,构建表达载体ORF2-pET22,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF2融合蛋白。用纯化的重组ORF2蛋白作为抗原,ELISA检测人血清样本中的TTV-IgG抗体。结果ORF2基因与日本TA287株的同源性为99.3%。用TTV-PCR阳性的血清对重组蛋白进行了Western blot,结果在表达蛋白位置处出现了特异性反应条带。以ORF2蛋白为抗原的ELISA检测结果具有较好的准确性。结论已成功克隆了ORF2基因,并在原核细胞中表达。     

新城疫病毒TL1株L基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的对新城疫病毒TL1株L基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒L基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株TL1的L基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出L基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较L基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建L基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及原核表达

目的构建猪血凝性脑脊髓炎病毒株(67N)血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)原核表达系统,为建立特异性免疫学诊断方法提供备选材料。方法克隆猪血凝性脑脊髓炎病毒(67N)HE蛋白抗原表位富集区基因,构建重组表达质粒pET-HE,并在大肠杆菌中诱导表达。经包涵体的初步纯化,金属螯合层析进一步纯化HE蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测。结果大肠杆菌可高效表达HE蛋白,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42.2%。纯化后蛋白浓度为0.6 mg/ml,纯度为85.4%。所表达的蛋白可被兔抗猪血凝性脑脊髓炎阳性血清所识别。结论已成功构建猪血凝性脑脊髓炎病毒HE蛋白原核表达载体,重组HE蛋白抗原具有良好的特异性,可作为检测猪血凝性脑脊髓炎病毒血清抗体的候选抗原。     

禽流感病毒核蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以 1株H5N1 亚型禽流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　提取禽流感病毒RNA ,以RT PCR法扩增编码NP基因cDNA并测序 ,将其克隆到pET 2 8a原核表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE和Westernblot检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了核蛋白基因完整阅读框架 ,编码 4 98个氨基酸 ,构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量约为 5 5 0 0 0的重组蛋白 ,该重组蛋白具有良好的免疫原性。结论　已成功克隆和表达了禽流感病毒核蛋白基因 ,为禽流感新型免疫学诊断试剂的研制奠定了基础     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的克隆表达小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶(mtsAC)基因,并检测其活性,为后续研究提供技术平台。方法Trizol法提取小鼠睾丸组织总RNA,RT-PCR法扩增mtsAC基因,经测序正确后,克隆至真核表达载体pcDNA4-V5,转染HEK293T细胞,Western blot及免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达,并检测HEK293T细胞中cAMP的水平。结果所构建的重组表达质粒pcDNA4-V5-mtsAC经酶切和测序证明构建正确,插入的mtsAC基因长度为1549bp;表达的重组mtsAC蛋白相对分子质量为48000,在胞浆及胞核中呈均一性表达;转染质粒pcDNA4-V5-mtsAC的HEK293T细胞中cAMP的水平较未转染的HEK293T细胞升高约17倍,并可被NaHCO3和CaCl2激活。结论已成功克隆了mtsAC基因,并在HEK293T细胞中表达了具有活性的重组mtsAC蛋白,建立了可用于mtsAC特性研究及男性不育药物筛选的技术平台。     

重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化

目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化。方法分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致。所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%。经纯化后,纯度达85%以上。Westernblot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应。结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础。     

胰高血糖素基因克隆、表达及鉴定

目的 研制基因工程胰高血糖素,用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血 糖反应。方法 依据人胰高血糖素氨基酸组成序列,采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子,体外合成胰高血 糖素基因序列,克隆于ｐＧＥＸ－１Ｎ质粒,转化人ＢＬ２１（ＤＥ３）菌中,对阳性克隆转化质粒进行ＤＮＡ测序。用ＩＰＴＧ诱导 转化的胰高血糖素工程菌,产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白,经谷胱苷肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析后,由 Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ酶 进行柱上切割,最后用ＲＰ－ＨＰＬＣ得到纯化产物。产品用质谱法测相对分子质量,并对Ｎ末端１５个氨基酸测序。 结果ＤＮＡ测序显示克隆基因序列正确,产品相对分子质量为３４８６Ｊ末端１５个氨基酸序列与理论值相同,产率为 １．９ｍｇ／Ｌ。结论 获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌,适于快速生产天然序列重组胰高血 糖素。     

人血管生成素基因的克隆与表达

目的 为了获得人的血管生成素基因,并在原核表达系统中进行表达。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术 从人的肝脏组织中扩增出Ａｎｇ基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中进行序列分析,再亚克隆到原核表达到 ｐＥＴ２８ａ（＋）载体中。结果　构建了重组表达载体ｐＥＴＡ,转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后,经ＩＰＩＧ诱导,Ａｎｇ基因蛋白在 ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达了相对分子质量约为１７０００的重组蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明,外源蛋白的表达量 占菌体蛋白总量的１０．６４％。结论 Ａｎｇ基因的克隆与表达为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。     

DRG2基因的克隆、表达及抑瘤活性研究

目的　克隆、表达抑癌基因NDRG2 ,纯化后考察其对肿瘤细胞的抑制作用。方法　将NDRG2基因克隆进pQE30 M15表达载体 ,经DNA测序 ,IPTG诱导表达 ,SDS PAGE测定表达量及相对分子质量 ,复性后浓缩 ,脱盐 ,亲和层析纯化 ,对纯化表达产物进行一系列检测 ,考察其抑瘤作用。结果　克隆构建的表达载体经DNA测序证明构建正确 ,表达产物相对分子质量为 39977,表达量为 4 0 0 5 % ,纯度为 94 % ,等电点为 6 3,表达蛋白N端氨基酸序列正确 ,NDRG2蛋白对肿瘤细胞有较强抑制作用。结论　构建了NDRG2的pQE30 M15表达载体并取得高表达 ,该蛋白对 790 1和HHCC肿瘤细胞均有抑制作用 ,为基因功能研究奠定了基础     

重组人乳铁蛋白基因克隆及表达

目的　构建重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株 ,并对表达产物进行评价。方法　由外周血白细胞总RNA经RT- PCR克隆获得HLF基因结构cDNA ,测序后克隆入酵母表达载体获得质粒pPIC9K- HLF ,线性化后电转化入毕赤酵母 ,经G4 -18 YPD筛选多拷贝后进行甲醇诱导表达。结果　获得基因与GenBank中的人HLF0 1基因基本相符。 2株多拷贝菌株诱导表达产物均能与人HLF抗体反应 ,具有抑制大肠杆菌生长的作用。结论　获得了能分泌有活性HLF的重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株。     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析

目的　对水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。方法　将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18 T载体中 ,构建N基因重组质粒载体。进行PCR及限制性内切酶分析 ,筛选获得N基因插入的阳性克隆。经核苷酸序列分析 ,并与Genbank中的VSV编码核衣壳蛋白N基因序列进行比较。结果　该序列与VSVNewJersey型的 0 9/ 82 HD B株同源性最高 ,核苷酸和推测氨基酸的同源性分别为 98.9%和 98.8% ,有 13个核苷酸差异 ,伴有 5个氨基酸改变 ,第 72位的酪氨酸变为组氨酸 ,第 89位的缬氨酸变为异亮氨酸 ,第 183位的天冬氨酸变为天冬酰胺 ,第 2 0 5位的苯丙氨酸变为亮氨酸 ,第 4 18位的丙氨酸变为缬氨酸 ;与In diana型各株的同源性较低 ,与Glasgow株相比 ,核苷酸和氨基酸的同源性分别为 6 7.9%和 71.6 %。结论　已成功地克隆了水泡性口炎病毒N基因 ,为水泡性口炎免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础     

大鼠Endostatin在乳酸乳球菌中的克隆与表达大鼠Endostatin在乳酸乳球菌中的克隆与表达

目的　在乳酸乳球菌中克隆与表达大鼠endostatin。方法　采用RNA分离试剂盒从大鼠肾脏组织中提取总RNA ,用RT PCR方法扩增其endostatin基因 ,将该基因克隆进pUC19质粒中 ,转化大肠杆菌DH5a ,提取质粒 ,分离基因 ,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子nisin的pLA14 1质粒连接 ,经电击转化 ,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ90 0 0中 ,转化子在含有氯霉素的GM17培养基上培养。用nisin诱导endostatin表达 ,SDS PAGE和Westernblot鉴定表达产物。结果　表达产物相对分子质量约为 14 0 0 0 ,表达量约为 10mg L。结论　在乳酸乳球菌中可以表达出正确的大鼠endostatin重组蛋白 ,为下一步进行重组蛋白的活性检测以及临床实验提供了依据。