ns脉冲诱导细胞内电处理机理的研究进展

脉宽为ns级、场强≥10 kV/cm的脉冲电场能够对细胞内部结构产生影响而不会导致细胞外膜穿孔,即细胞内电处理效应。尽管细胞内电处理效应的机理目前还不是很清楚,但国内外学者一致认为细胞内电处理的根本原因是ns脉冲电场在细胞内膜上诱导出的跨膜电位超过了穿孔临界值,从而导致内膜穿孔。基于以上研究详细介绍了目前关于细胞内外膜跨膜电位的计算模型、方法及仿真计算结果,探讨了细胞内电处理的机理。宽脉冲电场难以透过外膜进入细胞内部,主要作用在外膜上,导致外膜发生电穿孔。随着脉冲宽度变小,电场对内膜作用增强。当脉宽减小到ns级时,脉冲电场感应出的内膜跨膜电位比外膜大,电场主要作用于膜内细胞器,诱导内膜穿孔,细胞结构和功能改变,即进行细胞内电处理。     

基于现场可编程门阵列的全固态高压ns脉冲发生器

为研究ns脉冲电场诱导肿瘤细胞的凋亡效应,结合Marx发生器原理和全固态开关技术,研制了一套基于现场可编程门阵列(FPGA)的多参数可调全固态高压ns脉冲发生器。该发生器主要包括高压直流电源、Marx电路、FPGA控制电路和负载4部分。Marx电路采用金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)作为控制开关代替传统的火花间隙开关,用二极管代替电阻。FPGA产生多路同步触发脉冲信号,通过光纤进行隔离后可作为MOSFET的原始控制信号,同步驱动多个MOSFET。FPGA控制电路控制充电电压和输出脉冲的宽度、频率,并具有保护功能。实验结果表明,该脉冲发生器可产生幅值(0～8kV)连续可调、脉宽(200～1 000ns)灵活可变、频率(1～1 000Hz)独立可控,前沿35ns的高压ns脉冲,为进一步探索ns脉冲电场生物医学效应奠定了基础。     

纳秒脉冲细胞内电处理机理及其研究进展

介绍了细胞内电处理效应的研究现状及其进展 ;重点描述了KarlHSchoenbach提出的脉冲电场与细胞相耦合的球形模型 ;探讨了细胞内电处理机理 ,即当脉冲作用于悬浮生物细胞时 ,随脉冲宽度变小 ,电场对细胞核及核膜影响增强 ,当脉宽大于细胞膜充电时间常数时 ,脉冲电场主要作用在细胞外膜上产生电穿孔 ;当脉宽小于细胞膜充电时间常数时 ,脉冲电场对细胞内进行电处理。     

ns脉冲电场发生器的研制及应用

为了研究ns脉冲电场诱导肿瘤细胞的凋亡效应,结合开关电源技术和脉冲功率技术,研制了一套多参数大范围独立可调的ns脉冲电场发生器。该发生器由高压直流电源、脉冲形成电路和辅助电路3部分组成,输出的脉冲幅值0～1.2kV内连续可调,重复频率1Hz～10kHz内连续可调,脉冲宽度分100、200、600和1000ns4级可调,脉冲个数可以任意预置,上升时间<30ns,并具有显示和保护功能。实验室调试和医学细胞实验结果表明,该发生器调节方便、性能稳定,能够有效诱导人肝癌细胞凋亡,为ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机理和阈值参数选择规律的深入研究奠定了基础。     

基于阿基米德螺旋线圈的高变化率脉冲磁场发生器

脉冲磁场治疗肿瘤凭借其无创性的优势具有良好的应用前景。感应电场和感应电流是脉冲磁场产生生物效应的原因之一。为了获得较大的感应电场来开展脉冲磁场治疗肿瘤的细胞实验,研制了1台基于阿基米德螺旋线圈和自击穿空气开关的高变化率脉冲磁场发生器。对阿基米德螺旋线圈周围空间的磁场和感应电场进行了计算,利用COMSOL Multiphysics软件对线圈的磁场分布特性进行了优化设计,并对研制出的磁场发生器性能进行了实测。最终,设计的阿基米德螺旋线圈为7匝、外径为21 mm,该线圈在细胞培养液中可产生的脉冲磁场参数为:磁感应强度幅值0.92 T、上升时间78 ns、脉冲宽度1.8μs,磁场的变化率达1.1×107 T/s,感应电场最大值为55.9kV/m,电场的均匀度达84%,最大的感应电流密度达1.7×104 A/m2。结果表明,此脉冲磁场发生器可以满足用于研究脉冲磁场治疗肿瘤相关的细胞实验的要求,为后续研究奠定了基础。     

细胞内外膜跨膜电位频率响应的仿真研究

为研究ns脉冲电场诱导细胞跨膜电位改变的效应,在提出一种球形单细胞内外膜跨膜电位频率响应模型后给出了细胞内外膜跨膜电位的仿真计算方法。通过对频率响应的仿真分析,发现外膜跨膜电位表现出一阶低通滤波器特性,而内膜跨膜电位表现出一阶带通滤波器特性。在内膜频率响应中心频率到上限截止频率的范围内,内膜跨膜电位大于外膜,同时能保持在较高水平,这将有利于诱导细胞内电处理效应。计算结果与实验结果相吻合,为ns脉冲电场治疗肿瘤的窗口参数合理选择提供了一定的理论依据。     

基于微带传输线的生物溶液处理用纳秒脉冲电场发生器研制

研究纳秒脉冲电场生物学效应需要相应的高压纳秒脉冲发生器。为此,基于微带传输线与固态开关技术,通过波传播过程分析阐释了Blumlein型微带传输线方波的形成原理;采用CST微波实验室仿真分析了微带传输线充电过程中的电场分布;制作了小型化的纳秒脉冲发生器样机,并搭建测试系统对其进行了性能测试。结果表明,在电转杯负载端得到的纳秒脉冲电压幅值在0~2 k V内可调(即对间隙距离为1 mm的电转杯负载,电场强度在0~20 k V/cm内可调),脉宽为100 ns,上升沿约为20 ns,重复频率在0~1 k Hz内可调。     

陡前沿方波对金黄色葡萄球菌的杀灭效果

为研究方波脉冲前沿陡度对高压脉冲电场技术(PEF)杀菌效果的影响,通过实验研究了前沿陡化的方波脉冲对金黄色葡萄球菌的杀灭效果。考察并比较了在不同电场强度、等效处理时间、电导率条件下,陡前沿方波和普通方波的杀菌效果。结果表明,脉冲电场的杀菌效果随着电场强度、溶液电导率、等效处理时间的增大而增强,且方波脉冲的上升时间对金葡菌的杀灭效果具有显著影响。上升时间为200 ns的脉冲电场处理后的细菌残存率比上升时间为2μs的脉冲电场的残存率大,且前者的温升比后者小。当杀菌效果相同时,陡前沿方波脉冲所需的等效处理时间比普通方波脉冲更短。此外,陡前沿方波脉冲杀菌效果的提升并非通过改变细胞形貌结构来实现,而是直接作用于细胞内部。     

纳秒级脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的窗口效应

ns级脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡用于肿瘤病变的治疗,展现出令人振奋的临床应用前景。由于ns级脉冲电场诱导的凋亡率高低与场强-脉宽等参数存在一定的选择性,使得目前脉冲参数的选择存在较大的盲目性。为寻求诱导肿瘤细胞有效凋亡的ns级脉冲电场参数,将不同参数组合(电压幅值9 kV,脉宽分别为1、50、100与200 ns,脉冲个数分别为10、30、60与80,频率1 Hz)的ns级脉冲电场作用于SKOV3细胞。利用AnnexinV/PI双染法检测细胞早期凋亡率和坏死率,DNA ladder凝胶电泳实验检测细胞晚期凋亡情况,AnnexinV/PI双染法以及DNA ladder凝胶电泳实验表明:细胞的早期凋亡率同施加的脉冲电场参数存在窗口效应,且脉冲参数为100 ns、30个脉冲时可得到最大的凋亡率与坏死率差值。     

陡脉冲电场对肝癌细胞线粒体跨膜电位的影响

为研究陡脉冲电场的凋亡效应,以人肝癌细胞为实验对象,采用激光共聚焦扫描显微镜观察陡脉冲电场作用下细胞内线粒体跨膜电位的实时变化。实验结果表明,陡脉冲电场能使线粒体跨膜电位下降,较高的电压峰值、较窄的脉冲宽度(600 V/100 ns)比较低的电压峰值、较宽的脉冲宽度(200V/1.6μs)能使线粒体跨膜电位更快地下降,并且在停止施加陡脉冲电场后线粒体跨膜电位仍然在不断下降,进而有可能使线粒体跨膜电位崩溃,从而诱导肝癌细胞凋亡,为陡脉冲杀伤肿瘤细胞提供了理论依据。     

细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用

为了研究细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用,将脉冲电场参数组合(电场强度10kV/cm,脉宽500ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于细胞骨架裂解的Hep-G2细胞。利用Annexin-V和碘化丙碇(propidium i-odide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死情况;采用荧光分光光度计观测线粒体跨膜电位和细胞膜穿孔的变化情况。试验发现:肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞凋亡和坏死大大降低(与单独脉冲处理组相比检验水平P<0.05),早期细胞凋亡由(16.94±2.87)%下降到(4.77±1.87)%;晚期凋亡和坏死由(20.94±3.09)%下降到(14.38±2.60)%;脉冲处理组和肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞线粒体跨膜电位都出现下降,但后者的线粒体跨膜电位却明显高于前者(P<0.05);单独脉冲处理组和细胞骨架缺失后脉冲处理组二者在相同时间点时其PI荧光强度无明显差异,且PI荧光随时间而变化的规律亦相似。上述结果表明:细胞骨架的缺失抑制了ns脉冲诱导细胞凋亡的线粒体通路,进而降低细胞凋亡水平,但对细胞膜的穿孔情况无明显影响。     

Effects of nanosecond pulsed electric field exposure on arabidopsis thaliana

Seven days old seedlings of Arabidopsis thaliana, suspended in a 0.4 S/m buffer solution were exposed to nanosecond pulsed electric fields (nsPEF) with a duration of 10 ns, 25 ns and 100 ns. The electric field was varied from 5 kV/cm up to 50 kV/cm. The specific treatment energy ranged between 100 J/kg and 10 kJ/kg. Due to electroporation of the plasmamembrane of the plant cells, the seedlings completely died off, when 100 ns pulses and high electric field pulses were applied. But even at the highest specific treatment energies, 10 ns pulses had no lethal effect on the seedlings. An evaluation of the leaf area 5 and 7 days after pulsed electric field treatment revealed values twice the area of sham treated seedlings up to a specific treatment energy of 4 kJ/kg, when the applied field amplitude was low or the pulse duration 10 ns. A growth stimulating effect after short pulse exposition clearly could be detected. Contrary to the growth inhibiting effect of plasmamembrane electroporation on the seedlings, a growth stimulation by nsPEF treatment does not scale with the treatment energy within the applied parameter range.     

ns脉冲电场诱导裸小鼠皮下人黑色素移植瘤凋亡

为研究ns脉冲电场对在体肿瘤的诱导凋亡效应,以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/c裸小鼠为对象,采用电场强度20kV/cm、脉冲宽度300ns的脉冲电场处理后,抑瘤效应宏观观察到肿瘤组织的生长受到显著抑制(P<0.01),透射电子显微镜观察到典型的凋亡细胞超微结构形态,免疫荧光染色法定性检测到caspase-3蛋白表达明显增强,用RT-PCR方法定量检测到caspase-3 mRNA表达明显增强(P<0.01)。实验结果证实了ns脉冲电场能有效抑制在体肿瘤组织生长,机制在于其通过活化肿瘤细胞caspase-3蛋白酶而诱导肿瘤细胞调亡,为ns脉冲电场治疗肿瘤提供了依据。     

纳秒脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的内质网信号通路分析

ns脉冲电场在诱导肿瘤细胞凋亡方面展现出诱人的应用前景。由于ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚未明确,严重阻碍了ns脉冲电场肿瘤治疗的临床进程。为进一步揭示其诱导凋亡的机制,将参数组合(电压幅值9kV,脉宽100ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于人卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)细胞。首先检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine aspartic acid specific protease-12,Caspase-12)蛋白的释放水平,其次用浓度分别为0、25、50、100μmol/L的钙螯合剂(BAPTA-AM)螯合细胞内的游离Ca2+,用Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡率,最后采用蛋白质印迹(western blot)技术检测了Caspase-12蛋白释放的变化。试验结果表明:ns脉冲诱导SK-OV3凋亡时引起了细胞内Ca2+升高,从而介导内质网凋亡信号通路。该研究结果将进一步揭示ns脉冲诱导凋亡的机制。     

Effects of submicrosecond, high intensity pulsed electric fields on living cells - intracellular electromanipulation

Development of technology to produce nanosecond duration pulsed electric fields has allowed examination of the effects of ultrashort duration, high intensity electric fields on living cells. Theoretically, high intensity (MV/m) electric field applications with durations of less than one microsecond, when shortened toward nanoseconds, should increasingly affect intracellular rather than surface membranes of living cells. Experimentally, square-wave, 60 ns duration, high energy (36-53 kV/cm) pulses applied in trains of 1-10 pulses result in progressive increases in the numbers of permeabilized intracellular granules in a human eosinophil cell model-without large surface membrane effects. Electron micrographic examination of cells treated in this way demonstrates alteration of intracellular granule morphology consistent with permeabilization of granule membrane, i.e., intracellular electromanipulation. Continuous microscopic examination of individual living cells exposed to long or short duration pulsed electric field applications shows that permeabilization of surface membrane (median 5 minutes) with anodic preference (electroporation) and prompt cellular swelling follow a single, long duration (100 microsecond) pulse. In contrast, after a single short duration (60 ns) pulse, onset of surface membrane permeability is delayed (median 17 minutes), the increased permeability shows no anodic preference, and cellular swelling is absent suggesting that these effects are due to intracellular electromanipulation rather than direct effects on the surface membrane. Submicrosecond, intense pulsed electric fields applied to living cells achieve preferential effects on intracellular rather than surface membranes, potentially providing new approaches for selective/generalized cell or tissue ablation, growth stimulation and tissue remodeling.     

Pulse generators for pulsed electric field exposure of biological cells and tissues

This paper describes three pulse generators: a spark gap switched coaxial cable, a spark gap switched Blumlein, and a solid state modulator, developed for applying ultrashort electrical pulses to biological materials in culture. Research has shown that ultrashort pulsed electric fields can induce apoptosis in biological cells, and that pulses as short as 10 ns with field amplitude greater than 1 W/m cause membrane phospholipid rearrangement and activation of the effector enzymes of apoptosis. Pulses of very short duration use only tens of mJ per mL per pulse to induce apoptosis and other intracellular effects without causing thermal trauma. The pulse generators discussed here, each of a different topology, deliver ns pulsed electric fields (nsPEF) to cells in liquid suspension, and can be modified to drive electrodes for external, surgical, or endoscopic treatment of tissues in situ.