重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(rhRMcAb)的质控方法和质量标准。方法采用小鼠中和试验(MNT)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分别测定6批rhRMcAb样品的中和活性;还原、非还原SDS-PAGE检测rhRMcAb样品的纯度;还原烷基化胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法分析rhRMcAb的肽图;焦谷氨酸肽酶去除N-端焦谷氨酸封闭后,氨基酸序列分析仪测定rhRMcAb的N-端氨基酸序列;表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定rhRMcAb与狂犬病病毒糖蛋白的亲和常数;按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhRMcAb的各项其他指标,并建立其质量标准。结果采用MNT和RFFIT2种方法检测6批rhRMcAb的中和活性,批间活性基本一致;3批rhRMcAb原液的还原SDS-PAGE纯度大于99.0%,非还原SDS-PAGE除抗体主带外,在高、低相对分子质量处分别存在一些次带;3批原液样品的肽图图谱与理化测定对照品一致;N-端氨基酸序列与理论序列一致;结合狂犬病病毒糖蛋白抗原的亲和常数为1.86×108/M;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求;建立的质量标准中,中和活性应不低于500IU/mg,SDS-PAGE及HPLC纯度应不低于98.0%。结论已建立了rhRMcAb的质控方法和质量标准,可用于rhRMcAb产品的检定。     

重组人纽兰格林生物学活性检测方法及质控标准

目的　研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法 ,并制定其质量控制标准。方法　采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验 (KIRA ELISA) ,通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法 ,同时建立了一套完整可行的质量控制标准。结果　重组人纽兰格林刺激MCF 7细胞表面ErbB2 ErbB3分子磷酸化的反应存在量 效关系 ,相关系数大于 0 98,原液的平均比活性为 85 10U mg± 115 0U mg。并对原液设立肽图、纯度等检测项目 ,对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目。结论　KIRA ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性 ,结果准确可靠 ,重复性好 ;建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量。     

重组F基因缺失型仙台病毒hFGF2基因治疗制剂质控方法及质量标准的建立

目的建立搭载2型人成纤维细胞生长因子(human fibroblast growth factor 2,h FGF2)重组F基因缺失型仙台病毒(Sendai virus,Se V)制剂(Se V-h FGF2/d F)的质控方法与质量标准。方法采用RT-PCR法对Se V载体中插入的目的基因h FGF2和缺失的F基因进行鉴别,同时扩增两个基因片段M-HN和h FGF2-NP,以鉴别该病毒;鸡红细胞凝集试验检测制品的血凝效价,并计算病毒颗粒数;免疫荧光法测定Se V-h FGF2/d F的感染滴度,结合病毒颗粒数计算其比滴度;Se V-h FGF2/d F体外感染COS7细胞后,ELISA法测定感染上清中h FGF2的表达量;将感染上清体外作用于BALB/c 3T3细胞,3T3细胞增殖法检测h FGF2的生物学活性;酚-氯仿法抽提样品的DNA,Pico-Green法测定制品中DNA残留量;PCR法检测腺病毒残留。结果重组Se V-h FGF2/d F基因组中h FGF2基因、F基因、M-HN片段和h FGF2-NP片段的RT-PCR鉴定结果与理论值相符;血凝效价为1∶512,病毒颗粒数为4.12×1010 VP/ml;感染滴度为2.06×109 CIU/ml,比滴度为5.0%;Se V-h FGF2/d F以MOI 10感染COS7细胞72 h后,ELISA检测上清中h FGF2的表达量为117.1 ng/ml;表达上清中h FGF2的生物学活性为437 IU/ml;DNA残留量为2.24 ng/ml;制品中腺病毒的PCR检测结果为阴性;其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及《中国药典》三部(2010版)要求。结论初步建立了Se V-h FGF2/d F的质控方法和质量标准,为保证该制品的安全、有效、质量可控奠定了基础,同时也为其他Se V载体基因治疗药物的质量控制提供了参考。     

人源化叶酸受体α抗体质控方法的建立

目的建立人源化叶酸受体α抗体的质控方法。方法应用基于表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术的BIAcore3000系统测定人源化叶酸受体α单抗与重组人叶酸受体α的亲和力,从而反映该抗体的功能;采用ELISA法测定其抗原结合力;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度;紫外分光光度法测定其蛋白含量;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;其他各项指标检测按《中国药典》三部(2005版)要求进行。结果人源化叶酸受体α单抗成品的平均相对百分效价为105%,RSD为6.0%。单抗成品及参考品与叶酸受体的结合力均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,其曲线相关系数在0.98以上,成品经3次测定,相对抗原结合力平均值为97%,RSD为25%。还原SDS-PAGE分析显示,单抗成品的IgG重链和轻链百分比为98.2%;非还原SDS-PAGE分析显示,完整IgG百分比为96.7%;SEC-HPLC分析显示,单抗成品单体为99.1%,聚合体为0.9%。其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论已初步建立了人源化叶酸受体α抗体的质控方法,为该制品的质量控制奠定了基础。     

重组人源化抗程序性死亡受体-1单克隆抗体关键质控方法的建立

目的建立重组人源化抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体关键质量指标的质控方法。方法经胰蛋白酶切后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)肽图法对3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体进行鉴别,同时采用还原/非还原型十二烷基磺酸钠毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)法、分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cIEF)法、阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法及混合淋巴细胞反应与竞争ELISA相结合的方法分别检测3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体的纯度、单体和聚体含量、等电点、不同电荷异构体的含量及生物学活性。结果 3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体(批号为batch1、batch2、batch3)的肽图图谱与参考品一致;还原型CE-SDS的纯度分别为97.8%、98.1%和97.9%,非还原型CE-SDS纯度分别为95.7%、95.4%和95.5%;单体含量分别为99.3%、99.1%和99.4%,聚体含量为0.5%、0.6%和0.4%;主峰等电点均为7.4;酸性区含量分别为21.8%、21.4%和21.6%,主峰含量分别为58.4%、58.6%和58.7%,碱性区含量分别为19.8%、20.0%和19.7%;相对生物学活性分别为112%、98%和102%。结论本实验建立的重组人源化抗PD-1单克隆抗体关键质量指标的质控方法可用于该制品的常规质量控制。     

重组人骨形成蛋白-2的质量控制

目的建立重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)质控方法和质量标准。方法以小鼠体内异位成骨试验测定rhBMP-2的生物学活性,HPLC-SEC法测定纯度,蛋白N-末端测序仪测定N-末端15个氨基酸残基序列,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果1批rhBMP-2原液鉴定结果显示,样品比活性为5.9×104BU/mg,纯度为97.6%,N-末端序列为(MKR)LKSSCKRHPLYV,其余项目检测结果均符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论该质控标准可用于rhBMP-2产品的常规检定。     

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体质控方法与质量标准的建立

目的建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的质控方法和质量标准。方法利用乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制试验测定重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的生物学活性;RP-HPLC和SECHPLC测定其纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;荧光定量PCR检测E.coli宿主DNA残留量;ELISA法测定宿主蛋白残留量;Edman降解法进行N-末端序列测定;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按《中国药典》三部(2010版)规定进行。同时对通常在原液中进行检定的宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定进行初步的方法验证,考察其在成品中进行检测的可行性。结果经初步验证,在成品中进行宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定具有可行性,用建立的方法对重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。同时只对成品进行质控的方法和质量标准对同类产品的质量控制具有借鉴意义。     

重组人红细胞生成素质量控制体系研究

目的研究重组人红细胞生成素(rHuEPO)质量控制体系。方法用网织红细胞分析仪测活法测定rHuEPO体内生物学活性。比较不同的等电聚焦电泳条件、蛋白含量测定方法和牛血清白蛋白检测方法。按rHuEPO特点进行其他项目的检测。结果采用全自动网织红细胞计数仪检测rHuEPO体内生物学活性方法简便可靠;电泳时添加尿素可增加区带清晰度和条带清晰度;采用BSAELISA检测牛血清白蛋白含量可准确定量;免疫印迹试验可有效地检测rHuEPO成品质量。结论本研究建立了一套完善的rHuEPO质量控制体系。     

重组人源化抗DR5单克隆抗体质控方法的建立

目的建立重组人源化抗DR5单克隆抗体的质控方法。方法利用Colo205细胞杀伤试验测定重组人源化抗DR5单克隆抗体的生物学活性;SDS毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;成像毛细管等点聚焦电泳(imaged capillary isoElectric focusing,iCIEF)法测定等电点及电荷异质性;毛细管区带电泳(capillary zone dlectrophoresis,CZE)和肽图法进行鉴别试验;切糖后对N-糖进行2-氨基苯甲酰胺(2-amino benzamide,2-AB)标记,采用亲水相互作用液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)柱分离并结合质谱对其糖型进行分析。结果重组人源化抗DR5单克隆抗体生物学活性的EC50值为(9.09±1.03)ng/ml,RSD为11.33%。非还原CE-SDS主峰面积为(90.35±0.19)%,RSD为0.21%;还原CE-SDS重链和轻链峰面积共为(96.37±0.20)%,RSD为0.21%;SE-HPLC主峰面积为(99.14±0.13)%,RSD为0.13%。iCIEF分析主峰等电点为(8.95±0.00),RSD为0.00%;CZE和肽图法可对制品做出鉴别。糖谱分析方法相对灵敏。结论建立了重组人源化抗DR5单克隆抗体的质控方法,该方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国单克隆抗体的质量检测提供了参考依据。     

重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准的建立

目的建立重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法分别采用分子筛高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)、反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)和还原毛细管电泳(reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,rCE-SDS)测定3批重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白成品的纯度;采用AlphaScreen组氨酸检测试剂盒进行重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白受体配体结合试验测定效价;采用ELISA法进行鉴别试验;蛋白含量、pH值、渗透压摩尔浓度、Tween-20、不溶性微粒、外观、澄清度、生物学活性、水分、内毒素、无菌试验、异常毒性、渗透压等项目的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果 SE-HPLC、RP-HPLC及rCE-SDS测定3批供试品的纯度分别为>98%、>80%和>99%;重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白对血管生成素(angiopoietin,Ang)与酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains,Tie)结合的抑制作用呈剂量依赖性,3批供试品与标准品的剂量反应曲线相同,呈典型的倒S型,R2均>0.98,结合效价均在平均值的正负25%区间内;3批供试品的S/N值均>1.60;其他项目检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论建立的质控方法具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。     

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂质量控制研究

目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的质控方法和标准。方法采用黑色素瘤A375.S2细胞杀伤中和试验测定rhIL-1ra的生物学活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的质控方法对rhIL-1ra原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论建立的质控方法和标准可保证产品安全有效,可用于rhIL-1ra的检定。     

聚乙二醇重组人血管内皮抑制素质控方法的建立

目的 建立聚乙二醇重组人血管内皮抑制素的质控方法.方法 采用内皮细胞迁移荧光分析法测定样品的生物学活性;反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定样品的纯度和含量;胰酶消化法测定肽图;其余项目按<中国药典>三部(2005版)和二部进行检测.结果 用建立的生物学活性测定方法测定的3批原液的比活性分别为88.4、56.5和8...     

重组人干扰素α2b栓剂的检定及其临床疗效

目的对重组人干扰素α2b栓剂进行质量检定及临床疗效观察。方法连续试制3批样品,进行各项质控指标的检定及宫颈糜烂的临床疗效观察。结果本品各项检定指标均符合质量要求。治疗组宫颈糜烂的有效率为74·8%,对照组的有效率为60·0%。治疗组和对照组的副反应发生率分别为9·1%和8·3%。结论重组人干扰素α2b栓剂质量稳定,安全性好,疗效确切。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体质控方法的建立

目的建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法。方法采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量。按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测。结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09～2.16)×106U/ml,比活性均大于3.5×105U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105U/mg。3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0%,RP-HPLC纯度均大于97.0%;经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000;样品原液的单链含量为75.7%;3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致;TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定。     

长效干扰素质控方法的研究

目的　研究和确定新型长效干扰素制品质量控制方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统测定干扰素的生物活性 ,采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,采用毛细管等电聚焦法测定样品的等电点 ,应用胰蛋白酶消化法测定肽图。结果　确定了长效干扰素制品的质控方法 ,应用该方法测定 3批长效干扰素比活性为 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量为 6 30 5 7,等电点为 5 .6。结论　建立的质控方法可以有效地控制长效干扰素的制品质量。     

重组类人胶原蛋白的分离纯化

目的 建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺。方法 将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离纯化。结果 发酵菌体干重达到71g/L,表达量为菌体蛋白量的29.4％,最终产物纯度达98％,回收率为80.5％,纯化倍数为3.4。结论 纯化的类人胶原蛋白达电泳纯,相对分子质量为90 000,N端序列为NH_2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G,均与其因序列设计一致。