基于CRISPR/Cas9系统的金针菇基因组编辑载体构建

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9,构建金针菇基因Mads-8敲除载体及转化体系。以转录组数据为依据,通过分析基因Mads-8序列信息,选择高效的靶位点序列,同时加入筛选标记基因hph构建过渡载体sgRNA-T,通过菌落PCR鉴定和测序来验证靶位点序列是否正确插入。以表达载体pg Fvs-cas9为框架,酶切连接后构建重组敲除载体pg Fvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鉴定敲除载体。再以PEG介导的金针菇原生质体转化表达载体,在潮霉素抗性平板上筛选拟转化子,以拟转化子基因组DNA为模板扩增Cas9基因。结果显示,靶位点序列成功插入敲除载体且序列正确,重组质粒成功转化进金针菇的基因组。对金针菇基因组敲除载体的构建,为后续金针菇相关基因的功能验证及育种研究提供载体材料及理论依据。     

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。     

II型CRISPR系统在微生物中的应用

CRISPR系统是一种新兴的基因编辑技术,是存在于部分细菌中的一种免疫反应系统,利用Cas基因编码的蛋白对进入细胞中的外源DNA进行高效识别并切割,保护细菌自身免受外源基因侵害。CRISPR系统主要应用于基因的定点敲入和敲除。该系统具有操作简便,适用范围广等优点,已在各类微生物和动植物中广泛应用。在CRISPR系统中,II型CRISPR系统是应用最为广泛的系统,是目前的研究热点。它包含CRISPR/ Cas9、CRISPRa和CRISPRi系统,由于CRISPRa系统目前应用较少,本文对CRISPR/ Cas9和CRISPRi系统在微生物中的应用研究现状进行综述,并对两种系统未来的发展进行展望。     

SpCas9蛋白的高效可溶表达及应用

规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达，但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白，内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。为实现化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9蛋白（SpCas9）在大肠杆菌中的高效可溶表达，进一步促进其应用及编辑技术的推广，本研究应用GB1促溶标签提高Cas9蛋白表达量及溶解度，同时通过使用多重启动子策略进一步提高了Cas9蛋白表达量。两种策略的组合使Cas9蛋白表达量提升了2.52倍。体外酶切分析显示融合GB1标签的Cas9蛋白功能活性不受影响。进一步组装RNP复合物转化黑曲霉宿主成功破坏了pyrG基因。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

CRISPR/Cas系统的核酸检测及其在食品安全快速检测中的应用

近年来,快速检测技术成为食品安全领域的一个重要研究方向。成簇规律间隔短回文序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白(Cas)组成的CRISPR/Cas系统因优越的靶向性而被广泛应用于核酸检测中。基于CRISPR/Cas系统的核酸传感器具有灵敏度高、特异性强、时效性快等优势,成为快检领域的研究热点,也推动了食品安全快速检测技术的发展。本文基于CRISPR/Cas系统进行综述,分析不同的CRISPR/Cas系统结合核酸技术在靶标检测中的应用情况,展望CRISPR/Cas核酸传感器在食品安全快速检测领域的未来研究方向,为研发基于此核酸传感器的新型检测方法提供参考。     

球等鞭金藻Cry1-like基因克隆及生物信息学分析

隐花色素(cryptochrome)基因家族作为蓝光受体的一大类,广泛存在于动植物体内,介导了植物和动物的各种光响应。文章通过实验克隆出球等鞭金藻(Isochrysis galbana)一条隐花色素基因,该基因DNA全长2916 bp,cDNA全长2316 bp,由771个氨基酸组成。对其进行相关生信分析,预测该基因是球等鞭金藻Cry1基因(文中称为Cry1-like基因),克隆得到的Cry1-like基因能够为后续球等鞭金藻隐花色素基因结构与功能研究提供依据。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究

CRISPR/Cas9是一种重要的基因组定向编辑技术,近年来在植物基因组的定向敲除和分子育种材料创制中得到了广泛应用。为了发掘可用于分子育种的低烟碱烟草,以烤烟品种K326为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制烟草烟碱合成和转运的5个基因（PMT1、QPT1、A622、NtNUP1和JAT1）进行定向敲除,并对T2代纯合基因型烟草植株进行烟碱含量检测。结果表明,定向敲除5个基因后获得100株成功编辑的T0代烟草植株,突变检出率为29.9%,突变类型以单碱基插入或删除为主。对定向敲除烟碱合成基因QPT1和转运基因JAT1的T1代纯合基因型烟草植株进行序列分析,发现存在4种突变类型,分别是插入一个T、C、A碱基的插入突变和一个缺失44个碱基的缺失突变,从而引发移码使得翻译的氨基酸链大幅缩短,其T2代植株上部叶烟碱含量显著低于野生型植株。综上所述,CRISPR/Cas9技术能够高效定向敲除烟碱关键基因,为低烟碱烟草分子育种提供了理论和技术支撑。     

利用CRISPR/Cas9技术的烟草NtLS基因敲除分析

为了培育无腋芽或少腋芽烟草,基于CRISPR/Cas9系统,对烟草NtLS基因进行靶向基因组编辑,构建了2个特异靶向NtLS基因的CRISPR/Cas9载体cLS1和cLS2,并借助农杆菌介导的烟草转基因技术转化烤烟品种K326,获得20株抗卡那霉素的阳性烟株。10株阳性烟株经过PCR扩增、测序和比对,检测到2株发生蛋白翻译错误的T_0突变烟株。研究结果不仅为腋芽形成的分子机理研究创制了有价值的突变体,而且为培育无腋芽或少腋芽优质烤烟品系提供了遗传材料。     

基于细胞融合开发双基因共敲除技术

基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实.然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长.细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞.但是,由于基因的互补作用,通过基因敲除而获得的性状在细胞融合后成为隐性性状,融合细胞不能表现...     

DBP对球等鞭金藻和三角褐指藻的致毒效应

有机污染物邻苯二甲酸二丁酯(DBP)作为塑化剂被工业生产广泛使用,为了研究其对球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的致毒效应,设置6个质量浓度梯度,分别测定两种藻的藻细胞密度和光合色素质量浓度。结果表明,DBP对球等鞭金藻和三角褐指藻均有致毒效应,抑制球等鞭金藻和三角褐指藻的细胞生长,使其细胞密度降低,并对光合色素叶绿素a产生一定的破坏作用,抑制作用随DBP质量浓度升高而增大。当DBP质量浓度为5.0 mg/L时对三角褐指藻的毒性抑制作用明显增强,三角褐指藻前2 d几乎停止生长,于第3 d恢复了生长,藻细胞密度和叶绿素a的质量浓度均明显低于空白对照组;当DBP的质量浓度为7.0 mg/L时,三角褐指藻藻细胞几乎全部死亡,不能耐受。当DBP质量浓度为5.0 mg/L时,球等鞭金藻几乎全部死亡;当DBP质量浓度为0.5 mg/L时球等鞭金藻的细胞密度和叶绿素a的质量浓度已显著低于空白对照组。球等鞭金藻对于DBP反应较三角褐指藻敏感。     

大肠杆菌中吡咯喹啉醌合成途径的构建

目前吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）在大肠杆菌中的异源合成主要以质粒为表达载体进行,但是质粒载体难以进行合成途径多基因表达的系统优化,并且容易造成发酵不稳定。作者以大肠杆菌为底盘生物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在基因组水平系统优化PQQ的合成。将来源于Gluconobacter oxydans 621H的操纵子pqqABCDE引入底盘大肠杆菌,并进一步通过优化合成途径基因表达强度,敲除大肠杆菌自身抑制基因及强化PQQ的胞内需求与胞外转运等,获得了一株能够高效合成PQQ的工程菌,摇瓶发酵72 h时产量达到86.3 mg/L。以大肠杆菌为底盘构建PQQ高效合成途径的工作能够为后续以其他底盘生物生产PQQ及相关代谢产物提供借鉴。     

可切换亲水溶剂高效提取藻油及岩藻黄素含量分析

采用可切换亲水溶剂N,N-二甲基环己胺(DMCHA)从湿三角褐指藻藻泥以及干粉中通过非蒸馏的节能方式提取藻油,并比较DMCHA法与氯仿甲醇法及乙醇法提取的藻油岩藻黄素总含量。结果表明:在料液比1∶25、提取时间24 h条件下,三角褐指藻干粉藻油得率达到21. 29%,三角褐指藻藻泥的藻油得率达到13. 29%; SEM观察发现提油后三角褐指藻表面结构有明显的破坏;DMCHA法提取的藻油中岩藻黄素总含量为9. 17 mg/g,与氯仿甲醇法相差不大,低于乙醇法提取的藻油中岩藻黄素总含量;核磁分析发现,藻油中的溶剂残留仅为提取溶剂添加量的0. 231%,测定溶剂回收率为93. 2%。     

CRISPR/Cas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展

食源性病原菌引起的食品安全事件引起广泛关注,为保证食品安全,采取有效的检测手段至关重要。新兴的簇状规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其关联蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统,可高效、特异性识别并切割外源核酸,与传统技术相比在检测病原菌方面更为高效。本文基于CRISPR/Cas生物传感系统-等温扩增技术联用的相关研究进行综述,对CRISPR/Cas系统的分类、原理以及与等温扩增耦合后在食源性病原菌检测方面的研究进展进行概述,并对其在即时检测应用中的前景以及所面临的挑战进行深入探讨,以期为CRISPR/Cas生物传感系统的进一步发展提供参考。     

CRISPR- Cas12a 检测牛奶中大肠杆菌方法的建立与评价

为提高牛奶中大肠杆菌的检测效率,简化分析流程,该文建立基于成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）的牛奶中大肠杆菌快速检测体系。首先,构建CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated protein,CRISPR-Cas）,CRISPR-Cas12a 的重组表达质粒,并将其转化至BL21 感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（lsopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达Cas12a 蛋白。然后,通过麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）亲和层析、凝胶过滤层析等方法将Cas12a 蛋白进行纯化。最后,设计靶向大肠杆菌16S rDNA 目的片段的特异性CRISPR RNA（crRNA）,将特异性的crRNA、大肠杆菌16S rDNA 的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）胶纯化产物和纯化的Cas12a 蛋白进行混合,建立CRISPR-Cas12a 靶向切割体系。验证结果显示该体系可用于检测牛奶样品中的大肠杆菌。     

温度对海洋微藻生长及脂肪酸组成的影响

研究了不同温度下,三角褐指藻和等鞭金藻生长及脂肪酸组成.结果表明,三角褐指藻的最适生长温度为20℃,而等鞭金藻的最适生长温度为25℃.无论是三角褐指藻的EPA还是等鞭金藻的DHA,均随着培养温度的升高而下降.低温有利于三角褐指藻积累EPA和PUFAs,但PUFAs含量（W/W）在10-20℃之间差异不显著（P＞0.05）.虽然等鞭金藻DHA含量随着温度的上升而下降,但PUFAs在20℃时含量（W/W）最高,为10.5%.不同海洋微藻不仅具有不同的生长温度,且最适PUFAs合成的温度也不同.     

CRISPR-Cas系统在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR/Cas系统已被广泛的应用于核酸检测,并在对食源性致病菌的检测中展现出快速、灵敏度高、特异性强等优势。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制,总结了CRISPR/Cas系统与不同扩增方法和信号输出模式相结合在食源性致病菌检测中的应用,并讨论了这些检测方法存在的一些问题和挑战,最后对该技术的未来发展前景进行展望,旨在为食源性致病菌的快速检测提供新思路。     

CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测新技术中的研究进展

食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和关联蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,其高效特异序列识别及切割活性的特性,为食源性致病菌高灵敏、快速检测提供了一种新的途径。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制及发展,总结了近年来基于CRISPR/Cas系统结合不同结果报告方式用于食源性致病菌快速检测的最新进展,并对其优势、局限性和未来发展方向进行了讨论。