高产 β-丙氨酸基因工程菌的构建与优化

为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)基因,在E.coli BL21 (DE3)中异源表达,得到重组菌后,采用不同方法进行优化。通过选用不同表达载体、对目的基因序列进行密码子优化以及对菌株进行自动诱导的策略,逐步提高目的蛋白的表达量,进而提高β-丙氨酸产量。结果表明,经优化后,菌株30a-1的β-丙氨酸产量提高到140.82mmol/L,较优化前提高了2.5倍。     

提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性

以E.coli DH5a基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T栽体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coli BL21(DE3)和E.coli origami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在E.coli origami(DE3)中的可溶蛋白含量比E.coli BL21(DE3)中高.融合蛋白的可溶部分经Ni2+螯合亲和纯化,纯化后E.coli origami(DE3)中蛋白活性比E.coli BL21(DE3)中明显提高,达到1 614.3U/mg蛋白.     

重组大肠杆菌产L-阿拉伯糖异构酶的条件优化

L-阿拉伯糖异构酶可以将D-半乳糖催化为D-塔格糖,为提高E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-araA产L-阿拉伯糖异构酶的能力,分别优化了该基因工程菌发酵基础培养基中的碳源、氮源和诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时长。结果表明,采用优化后的发酵基础培养基和诱导产酶条件生产的L-阿拉伯糖异构酶的酶活力可达到80.1 U/mL,是优化前的1.8倍。L-阿拉伯糖异构酶与90 g/L的D-半乳糖在55℃的水浴振荡器中反应12 h, D-半乳糖的转化率可达到44.2%。     

L-天冬氨酸α-脱羧酶异源表达和转化条件的优化

为提高L-天冬氨酸α-脱羧酶粗酶液催化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的效率,研究了诱导剂添加时间、诱导剂浓度、诱导温度和培养时间对重组菌株产酶的影响,并优化了粗酶液的反应温度、pH和底物浓度等转化条件.得到最优诱导条件:在OD600达到0.6左右时加入诱导剂IPTG 0.5 mmol/L、25℃下诱导表达18h时,酶活力达...     

杂合抗菌肽MT在大肠杆菌中的融合表达

为了在大肠杆菌中表达杂合抗菌肽Magainin-Thanatin(MT).通过大肠杆菌密码子偏爱性优化两抗菌肽基因序列,SOE-PCR技术构建克隆载体并测序;将其转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中构建基因工程菌,表达产物做抑菌活性分析.结果在本研究中经SOE-PCR拼接后得到了杂合肽片段,成功构建了表达载体pGEX-6P-1-MT;转化后得到了重组菌株pGEX-6P-1-MT/BL21(DE3);获得诱导产物分子质量约3.35kDa;其对大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌等均有抑制作用.这表明杂合肽MT可以在大肠杆菌BL21(DE3)中融合分泌表达且具有抗菌活性.     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

群体感应淬灭酶AiiO的克隆表达及其发酵工艺优化

群体感应淬灭酶AiiO具有降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的活性,从而抑制病原菌的致病性。为提高AiiO表达量,构建了重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO,对其发酵生产AiiO过程中诱导温度、氮源质量浓度、诱导时机和乳糖添加量进行了优化。结果表明,在诱导温度25℃、蛋白胨20 g/L和酵母粉10 g/L、发酵初始时添加乳糖、乳糖添加量为5 g/L的优化条件下,胞内可溶性AiiO的表达量达到374.26 mg/L。     

HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

构建了丙型肝炎病毒e2-3pcx融合基因的原核表达载体pET28b(+)-e2-3pcx,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。IPTG诱导融合蛋白高效表达。经SDS-PAGE电泳分析,结果表明在43 ku处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.     

HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

反硝化产碱菌Alcaligenes sp.TB氧化亚氮还原酶基因的克隆表达及酶学性质研究

氧化亚氮(N2O)是一种重要的温室气体,对全球温室效应的贡献非常显著,反硝化细菌中存在氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase,Nos)能将其最终还原成氮气。将生物转鼓反应器中筛选得到的一株高效反硝化产碱菌Alcaligenes denitrificans TB作为供试菌株,构建含有nosZ基因序列的原核重组表达菌株,经IPTG诱导完成在大肠杆菌中的表达,其最佳诱导条件为:诱导剂IPTG终浓度为0. 5 mmol·L-1,诱导温度为28℃,诱导时间为6 h,菌体初始浓度(OD600)为0. 67。再利用亲和层析分离纯化得到重组蛋白,通过检测显示重组菌E. coli BL21(DE3)-pET28b-nosZ酶活力是出发菌株Alcaligenes sp. TB的2. 09倍,蛋白相对含量是其10. 58倍。进而考察了反应体系pH和反应温度对酶催化反应的影响,结果显示,当pH为7. 0,温度为40℃时得到最佳酶活。     

以菊粉为底物全细胞催化生产甘露醇

将Leuconostoc mesenteroides来源的甘露醇脱氢酶(mdh)及Mycobacterium vaccae来源的甲酸脱氢酶(fdh)的共表达载体pRSFDuet-mdh-fdh,与葡萄糖辅助蛋白(glf)的表达载体pZY507glf共转入大肠杆菌BL21(DE3)中,成功构建了一个可将果糖转化为甘露醇的全细胞催化剂E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdh pZY507glf。该全细胞催化剂在pH 6.5、温度30℃时,具有最高的转化效率,甘露醇的产率可达到0.91g/g。通过与高活力的菊粉酶协同作用,甘露醇的产率可达到0.93g/g。     

建兰花色调控关键基因的克隆与表达

对建兰花色形成的关键调控基因(CHS)编码区片段克隆至pET28a质粒,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3).SDS-PAGE检测表达产物,针对IPTG浓度、温度与时间等因素,优化其最佳诱导表达条件.结果显示:(1)总RN A提取质量高,经反转录成cDNA,设计引物通过PCR扩增,琼脂糖电泳显示片段为1200 bp;(2)对转化子进行菌落PCR与质粒双酶切鉴定,片段大小均为1200 bp与预计相符,经测序获得片段插入方向正确,未发生突变,可用于蛋白诱导表达;(3)诱导表达优化显示,温度为37℃、IPTG浓度1 mM及诱导时间6 h是重组子(pET28-CeCHS1)在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达的最佳条件.     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

斑节对虾carcininPm3的表达及其无标签多肽的获得

crustin是对虾中重要的抗菌肽,本研究获得的carcinin Pm3属于斑节对虾crustin家族,是一种新型抗菌肽,成熟肽含有92个氨基酸,与其他对虾抗菌肽的同源性小于45%.根据其氨基酸序列和大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)的密码子偏好性设计carcinin Pm3的基因序列,将carcinin Pm3连接到原核表达载体pSmartI-SUMO上,构建重组表达载体p SmartI-SUMO-carcinin Pm3,再转化至原核表达菌株E. coli BL21 (DE3)中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导SUMOcarcinin Pm3的融合表达,进一步优化其表达条件,获得表达量大、可溶性高的重组蛋白.通过亲和层析纯化得到重组蛋白,蛋白的质量浓度达到195μg/m L.利用SUMO酶去除SUMO融合标签,获得没有外源标签的carcinin Pm3抗菌肽,可用于蛋白功能分析、抗体制备等研究.研究结果为carcinin Pm3功能的分析及应用提供参考.     

醛糖还原酶cDNA的克隆和表达

醛糖还原酶能促使葡萄糖转化成山梨醇,是多元醇代谢通路的限速酶,与糖尿病并发症的发生和发展有密切关系.用RT-PCR扩增醛糖还原酶基因,将扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b(+)-AR.经PCR、双酶切和序列测定鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定后,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得重组蛋白AR-(His)6.紫外分光光度法对AR-(His)6进行酶活检测,其比活力为0.45 U/mg,为下一步筛选具有抑制醛糖还原酶活性的化合物及开发有临床应用价值的醛糖还原酶抑制剂提供参考.     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

GABAB受体蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及复性

在大肠杆菌中培养含有pET28c质粒的BL(DE3),1mmol·L-1IPTG诱导表达,收集包涵体蛋白,对其进行初步洗涤纯化,然后用8 mol·L-1尿素溶解,在变性条件下(8 mol·L-1尿素)经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化,得到的电泳纯的蛋白,纯度可达95%以上.采用柱上复性的方法对包涵体蛋白进行复性,依次以含有6,5,4,3,2,1,0 mol·L-1尿素的Refolding buffer缓冲液洗柱,此方法可实现蛋白的同时纯化及复性.     

生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。     

凋亡蛋白对Hep2细胞影响的研究

从鸡贫血病毒(CAV———ch icken anem ia virus)总DNA中克隆凋亡蛋白(Apoptin)基因片段,并与pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体构建融合载体,转化E.coli.DH5α,筛选氨苄抗性阳性克隆并鉴定.以该融合载体转染Hep2细胞后,在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光标记,同时观察到细胞核形态学呈凋亡特征变化,表明凋亡蛋白可以诱导Hep2细胞系发生凋亡.