嘧啶核苷高产菌的代谢控制育种策略

选育嘧啶核苷高产菌是实现发酵法生产胞苷、尿苷的前提。文中分析了枯草芽孢杆菌中嘧啶核苷的生物合成途径及其代谢机制,提出嘧啶核苷高产菌的育种策略:以能大量积累肌苷的枯草芽孢杆菌为出发菌株,胞苷高产菌株在遗传学上应具备CRDAE-、5FCRr、6AUr、3DUr、HAD-等遗传标记,尿苷高产菌株在遗传学上应具备2TUr、6AUr、UP-等遗传标记。     

基于逐步回归分析何首乌中核苷类成分

分析何首乌中10 种核苷类成分,探讨10 种核苷类成分含量对总核苷含量的影响程度。采用超高效液相色谱-串联四极杆-线性离子阱质谱技术测定何首乌中10 种核苷类成分的含量,应用逐步回归分析方法得到10 种核苷类成分含量对总核苷含量影响程度的最优方程。结果显示何首乌核苷类成分中以尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胞苷含量较高;逐步回归分析显示尿苷、胞苷和胸苷含量对总核苷含量的影响最为显著。尿苷、胞苷和胸苷含量可标示总核苷作为何首乌药材质量评价的一项指标,为何首乌药材质量的多指标评价体系构建提供科学依据。     

细脚拟青霉深层发酵菌丝体核苷类成分分析

以已知核苷为标样,并以冬虫夏草生药作对比,利用反相高效液相色谱法对细脚拟青霉RCEF0441 深层发酵菌丝体中核苷类化学成分进行分析。结果表明,细脚拟青霉RCEF0441 菌丝体中主要含有胞苷、尿苷、鸟苷、肌苷、胸苷和腺苷6 种核苷,其中胞苷的含量为冬虫夏草生药的3 倍左右,肌苷和鸟苷的含量则分别是冬虫夏草生药的7 和9 倍左右,尿苷和腺苷的含量也显著高于对照品冬虫夏草生药(p<0.05)。     

古尼拟青霉小孢变种核苷类成分分析

以已知核苷为标样,并以冬虫夏草生药作对比,利用反相高效液相色谱法对古尼拟青霉小孢变种RCEF0864菌丝体和发酵液中核苷类化学成分进行分析,结果表明古尼拟青霉小孢变种RCEF0864菌丝体中主要含有胞苷、尿苷、鸟苷、肌苷、环磷腺苷和腺苷等6种,其中腺苷和尿苷的含量均为冬虫夏草生药的3倍左右,肌苷和鸟苷的含量则分别是冬虫夏草生药的7倍和10倍左右,尿苷的含量也高于对照品冬虫夏草生药。古尼拟青霉小孢变种RCEF0864发酵液中主要含有尿苷、胞苷、胸苷、肌苷、环磷腺苷和腺苷等6种核苷类物质,其中,腺苷和胞苷的含量均高于对照品冬虫夏草生药。     

胞苷产生菌的选育

选育胞苷高产菌株是实现发酵法生产胞苷的前提.本文分析了枯草芽孢杆菌的嘧啶生物合成途径及其代谢调控机制.提出了胞苷高产菌株的育种思路:采用具有天然的磷酸单酯酶活力很高的野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株,选育具有胞苷脱氨酶缺失(CRDAE-)、6-杂氮尿嘧啶(6-AUr)、2-巯基尿嘧啶(2-TUr)、5-氟胞苷(5-FCr)等结构类似物抗性标记及高丝氨酸缺陷(HAD-)遗传标记的突变株.     

桃金娘果实花色苷提取物对两种假单胞菌生物被膜的抑制

为研究桃金娘果实花色苷提取物对隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)生物被膜的抑制作用,采用肉汤稀释法测定了桃金娘果实花色苷提取物对两种假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,在亚抑菌浓度下采用结晶紫微孔板染色法测定了桃金娘果实花色苷提取物对两种假单胞菌的抑制作用和粘附情况。结果表明,桃金娘果实花色苷提取物对两种假单胞菌均有一定的抑制作用,对隆德假单胞菌和荧光假单胞菌的最小抑菌浓度分别为1500和1000 mg/mL,在500 mg/mL的亚抑菌浓度下,桃金娘果实花色苷提取物对隆德假单胞菌和荧光假单胞菌生物被膜具有显著抑制效果,能够显著降低两种假单胞菌在接触面上的粘附量(p<0.05)。桃金娘果实花色苷提取物具有开发为隆德假单胞菌和荧光假单胞菌生物被膜抑制剂的潜在价值。     

基于分子生物学技术的胞苷生产菌的育种研究进展

胞苷是一种重要的抗肿瘤、抗病毒药物的中间体。传统的胞苷生产菌的育种策略多采用物理或化学诱变的方法,结合代谢产物类似物的抗性筛选手段,得到能够有效积累胞苷的菌株。随着分子生物学的发展,利用基因敲除技术,通过阻断细胞的代谢旁路或引入突变位点,能够有效改变目的产物的产量或质量。对代表性的胞苷生产菌株枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的胞苷生物合成途径进行分析,并对其分子生物学育种策略进行了综述。     

利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸

尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase,UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5'-uridine monophosphate,5'-UMP)和胞苷酸(5'-cytidine monophosphate,5'-CMP)。利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)分别成功克隆表达了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的尿苷-胞苷激酶。对比分析了不同重组尿苷-胞苷激酶的催化特性发现,来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶能以鸟苷三磷酸(Guanosine 5'-triphosphate,GTP)或者腺苷三磷酸(Adenosine 5'-triphosphate,ATP)作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸,而来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好。在优化的反应条件下,使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶,6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。研究结果表明,以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶可作为一种新型的催化剂用于尿苷酸的研制与生产。     

基于代谢途径分析的重组大肠杆菌BG20胞苷发酵条件的研究

胞苷是一种嘧啶核苷,主要用于生产药物的中间体。以重组大肠杆菌BG20为研究对象,对胞苷发酵条件进行了研究。首先分析了大肠杆菌中胞苷的生物合成途径,并根据胞苷合成的需要对发酵条件进行了优化设计;采用正交试验设计对初始葡萄糖浓度、硫酸铵、磷酸盐及p H、温度、溶氧控制等发酵条件进行了研究。结果表明,在500 m L摇瓶发酵条件下,得到胞苷发酵的最佳发酵培养基组分为:初始葡萄糖浓度160 g/L、硫酸铵浓度1.3%、磷酸盐浓度2.2%,最佳发酵条件为:温度38℃、转速180 r/min、p H7.2;对比分析了优化前后对菌体生长与胞苷产量的影响,胞苷的积累量达到0.2835 g/L,较优化前提高了61.4%。     

高效液相色谱法同时测定太白贝母与暗紫贝母中9种核苷类成分的含量

建立太白贝母和暗紫贝母中9种核苷类成分(尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2'-脱氧腺苷)的高效液相色谱法(HPLC)分析方法,并对核苷类的含量进行比较。采用Venusil MP C18(2)(4.6mm×250 mm,5μm)色谱柱,甲醇-水为流动相,梯度洗脱,流速1.0 m L/min,柱温35℃,检测波长260 nm为分析条件。在设定的试验条件下,9种核苷在30 min内实现了良好的分析,待测核苷成分在各自线性范围内,峰面积积分值与进样量质量浓度呈良好的线性关系(r=0.999 0~0.999 9),平均回收率为96.68%~101.35%(RSD3%)。结果表明:不同品种及同一品种不同商品名称的太白贝母和暗紫贝母中均含有9种核苷类成分,但含量上均存在差异,其中尿苷、鸟苷和腺苷含量较高,而尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸苷、2'-脱氧腺苷含量较低。松贝中核苷类成分的含量略低于青贝。太白贝母中胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2'-脱氧腺苷及其总含量整体上呈现出随着生长年限(花生大贝、花生小贝大尖、中尖、小尖松尖)增加而含量降低趋势,但尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤含量呈现出随着生长年限增加而增加的趋势。从整体上看,太白贝母中核苷类成分的含量高于暗紫贝母,具有化学等同性,2种基源的川贝母作为同一药材使用是可行的。     

洋河大曲产核苷功能菌的研究

利用涂布法、划线法等技术手段,从洋河成品大曲中分离得到1株代谢产生核苷类健康功能因子的丝状真菌。利用形态观察和分子生物学相结合的技术手段,将核苷代谢功能菌鉴定为横梗霉。高效液相分析表明,该菌可代谢产生具有重要生理活性的次级代谢产物——腺苷和尿苷。该研究为核苷健康功能菌在中国白酒酿造中的应用奠定了基础。     

4种虫草无性型真菌中核苷类成分比较分析

以已知核苷为标准品,并与冬虫夏草生药作对比,采用反相高效液相色谱法对蝉拟青霉RCEF1081、蛹草拟青霉RCEF0845、戴氏绿僵菌RCEF0772、长座被毛孢RCEF0717菌丝体中主要核苷类化学成分进行了比较分析。结果表明,蝉拟青霉中虫草素和鸟苷含量较高,分别为0.5752mg/g、0.2225mg/g;长座被毛孢中尿苷和肌苷含量较高,分别为3.8024mg/g、4.5146mg/g;戴氏绿僵菌中胸苷和腺苷含量较高,分别为4.9514mg/ g、3.9360mg/g,且均远远高于对照品冬虫夏草生药中的同种核苷含量。     

胞二磷胆碱的生产

胞二磷胆碱，中国药典2005年版定名为胞磷胆碱，英文名：Citichaline sodium，它的化学名称：胆碱胞嘧啶核苷-5’-二磷酸酯单钠盐，分子式：C14H25N4NaO11P2，分子量：510．31，化学结构式如下：     

蜂头虫草无性型——蜂头层束梗孢活性成分分析

测定了蜂头虫草无性型——蜂头层束梗孢(Hymenostilbe sphecophila Kob)HS01胞外多糖含量、5种核替代谢量和氨基酸含量。结果表明,胞外多糖含量最高可达1.75 g/L,胞内多糖含量最高可达2.423%;发酵液与菌丝体中均含有尿苷、鸟苷、肌苷、胸腺嘧啶核苷和腺苷5种核苷,其含量均高于对照品冬虫夏草生药;HS01发酵菌丝体与天然虫草生药在氨基酸种类上一致,但氨基酸总量和人体所必须氨基酸总量明显高于冬虫夏草生药,氨基酸总量为8.330 mg/g。     

谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究

核苷水解酶是一类催化核苷生成D-核糖及嘌呤或嘧啶的酶，广泛存在于除哺乳动物以外的生物中。该研究表达并纯化了3个来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的核苷水解酶Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835并考察其酶学特性。酶学实验结果表明，重组Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835均具有核苷水解酶活性；能够催化腺苷、胞苷、鸟苷、黄苷、肌苷和尿苷生成D-核糖和相应的嘌呤或嘧啶，但底物特异性有所差异；重组酶在15～55℃以及pH 4～10条件下均具有活性，其最适温度和pH分别为35℃和7.0;Cgl1977的热稳定性优于Cgl1364和Cgl2835。利用BL-cgl1364静息细胞为酶源催化水解尿苷，底物转化率达到89.5%。该研究首次报道了谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的功能和性质，可为D-核糖、嘌呤及嘧啶的“一锅法”生物合成提供重要参考。     

柚苷酶产生菌的选育及其酶特性研究进展

从柚苷酶产生菌的选育、产酶发酵条件、柚苷酶的提纯及其酶学特性等方面进行了综述.     

提取方法对接骨草中9种核苷类物质的影响

研究建立了高效液相色谱法测定核苷类物质含量及比较提取工艺对核苷类物质含量的影响。试验采用Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×150 mm),流动相A相为甲醇,流动相B相为纯水,梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,DAD检测波长为262 nm,柱温为30℃。检测方法显示:9种核苷类物质的检测线性范围为0.02～250 mg/L;检出限(S/N=3)在0.003～0.035 mg/kg之间;加标回收率(N=6)在85.38%～102.45%之间,检测方法灵敏有效。检测结果表明,不同提取工艺得到的接骨草中叶尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、次黄嘌呤核苷、鸟苷、胸苷和腺苷9种接骨草核苷类物质的总含量以亚临界萃取最高,亚临界萃取过程没有加热处理,最大程度地保留了接骨草核苷类物质;结果表明,从接骨草核苷类物质的含量及物质特性保留的角度考虑,选择接骨草的提取工艺以亚临界萃取为宜。     

仿生法提取马铃薯核苷类物质的同时检测

研究建立了高效液相色谱法测定核苷类物质含量及比较提取工艺对核苷类物质含量的影响。采用Agilent XDB C_(18)色谱柱(4.6 mm×150 mm),流动相A相为甲醇,流动相B相为纯水,梯度洗脱,流速为0.8 mL/min, DAD检测波长为260 nm,柱温为35℃。检测方法显示:9种核苷类物质的检测线性范围为0.02～500 mg/L;检出限(S/N=3)在0.004～0.049 mg/kg之间;加标回收率(N=6)在87.30%～105.29%之间,检测方法灵敏有效。检测结果表明,不同提取工艺得到的马铃薯中叶尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、次黄嘌呤核苷、鸟苷、胸苷和腺苷9种马铃薯核苷类物质的总含量以仿生法萃取最高,仿生法萃取过程没有加热处理,最大程度地保留了马铃薯核苷类物质;结果表明,从马铃薯核苷类物质的含量及物质特性保留的角度考虑,选择马铃薯的提取工艺以仿生法萃取为宜。     

不同产地地参核苷类成分的UPLC-MS-MS定性定量分析

该文建立1种地参中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷6种核苷类成分的超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatograph tandem mass spectrometer,UPLC-MS-MS）定性定量分析方法。采用纯水超声提取,以甲酸水溶液（pH4.0）-甲醇为流动相,在Agilent SB-C18色谱柱上梯度洗脱,正离子多反应监测模式测定,并采用差异性分析、聚类分析和相关性分析对测定结果进行比较。结果显示：6种核苷类成分在各自的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.995 2～0.999 9,检出限为0.07 ng/mL～8.34 ng/mL,加标回收率为96.30%～103.71%,相对标准偏差值为0.68%～2.32%。核苷含量结果显示不同产地间存在一定差异性（p<0.05）,其中江苏徐州（S7）样品中核苷总量最高;6种核苷类成分中尿苷和鸟苷含量居首,分别占比核苷总量的35.60%和34.60%,是地参中主要的核苷类成分。该方法定性定量准确、分析速度快、灵敏度高,可用于不同产地地参中6种核苷类成分的分析。     

不同提取工艺下艾叶中核苷类物质的同时检测

建立高效液相色谱法测定核苷类物质含量并比较提取工艺对核苷类物质含量的影响。采用Reprosil-Pur Basic C18色谱柱(4.6 mm×150 mm),流动相A相为甲醇;流动相B相为纯水,梯度洗脱,流速1.0 m L/min,DAD检测波长260 nm;柱温40℃。检测方法显示,9种核苷类物质的检测线性范围为0.02~200 mg/L;检出限(S/N=3)在0.003~0.02mg/kg;加标回收率(N=6)在86.45%~106.88%、检测方法灵敏有效。检测结果表明,不同提取工艺得到的艾叶中叶尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、次黄嘌呤核苷、鸟苷、胸苷和腺苷9种艾叶核苷类物质总含量以亚临界萃取最高,亚临界萃取过程没有加热处理,最大程度地保留艾叶核苷类物质;结果表明,从艾叶核苷类物质含量及物质特性保留的角度考虑,选择艾叶的提取工艺以亚临界萃取为宜。