幽门螺杆菌过氧化氢酶基因克隆及表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)过氧化氢酶(katA)基因并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,将其克隆入pET-11c载体中,经测序证实后,在大肠杆菌中进行表达,产物用Western blot检测其抗原性并进行N末端氨基酸的测序。结果 幽门螺杆菌katA基因全长1 518bp,编码氨基酸505个。在BL21(DE3)中的表达量约占细菌总蛋白的24.9％,表达产物经SDS-PAGE显示其相对分子质量与软件预测结果 58 000相符,N末端5个氨基酸测序结果与Hp中天然的katA完全一致,经Western blot检测可被 Hp全菌抗血清识别。结论 katA能在大肠杆菌中进行高效表达,具有良好的免疫反应性,可望为研究 Hp的致病机理、实验诊断及亚单位疫苗等提供充足的katA原材料。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆和表达

目的　扩增幽门杆菌热休克蛋白A 35 1bp的DNA片段 ,并将其克隆到pET - 2 8a(+ )质粒中高效表达。方法　用PCR方法扩增的片段经测序后 ,用GoldKey分析软件进行序列分析 ,应用pET - 2 8a(+ )系统在受体菌BL2 1(DE3)pLysS中表达热休克蛋白。结果　该序列表达的蛋白与已报道的热休克蛋白A序列相似。重组菌株用IPTG诱导后 ,经SDS PAGE和薄层扫描分析 ,表达的外源蛋白的相对分子质量为 180 0 0 ,以包涵体的形式存在 ,表达产物占菌体总蛋白的 6 4%。结论　HspA是最有可能做为H .p疫苗中的候选抗原成分     

幽门螺杆菌hp1188基因的克隆及高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础。方法用PCR法从H.pylori标准株NCTC11637基因组DNA中扩增hp1188基因,克隆入原核表达载体pQE-30,构建重组原核表达质粒pQE30-hp1188,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达形式和表达量。表达蛋白经Ni2+-NTA树脂纯化,Western blot鉴定其反应原性。结果所构建的重组表达质粒pQE30-hp1188序列完整,插入的基因片段全长810bp,与GenBank中的hp1188基因同源性达98%。表达的重组蛋白相对分子质量约为30600,以1.0mmol/L IPTG诱导4h,表达量最高,破菌上清和沉淀中均有表达,可溶性蛋白表达量占全菌总蛋白的47%。重组蛋白纯化后纯度可达90%,并可被H.pylori患者血清识别。结论已成功克隆了H.pylori hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。     

幽门螺杆菌HpaA重组蛋白的表达及免疫效果检测

目的表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白,并检测其抗原性和免疫原性。方法用PCR方法从H.pylori DNA中扩增hpaA基因片段,插入原核表达载体pQE-30,转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Ni2+-NTA树脂纯化后,用Westernblot鉴定其反应原性。用重组蛋白免疫家兔,检测其免疫原性。用重组蛋白免疫小鼠,分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量。结果重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确,所得序列完整,插入的基因片段全长783bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.3%。表达产物相对分子质量为30000,目的蛋白表达量占全菌总量的31.67%,主要存在于碎菌后上清中,纯度在90%以上。Westernblot显示该蛋白可与病人血清特异性结合,免疫血清能与重组蛋白反应,双扩散效价为1:16。小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组。结论已获得高纯度的HpaA重组蛋白,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制幽门螺杆菌疫苗。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌疫苗的研究进展

幽门螺杆菌是慢性胃炎和消化性溃疡乃至胃癌的主要致病菌,在人群中感染率较高,世界卫生组织已将其列为I类致癌因子。目前对幽门螺杆菌的联合药物治疗由于费用昂贵、病人依从性差、抗生素耐药等原因受到一定限制,为了有效控制幽门螺杆菌感染,疫苗的研发逐渐成为幽门螺杆菌研究领域的热点,疫苗接种是防治幽门螺杆菌感染最有前景的方法。本文综述了幽门螺杆菌疫苗的研究及其应用。     

幽门螺杆菌耐药研究进展

目的了解国内外幽门螺杆菌(HP)耐药的研究进展状况。方法综合国内外HP耐药研究文献,分析HP的耐药特点、产生耐药的分子机理及避免HP耐药的策略。结果不同国家和地区分离出的HP菌株对咪唑类、大环内酯类、β-内酰胺类均已产生不同程度的耐药,耐药菌株的产生可能与其自发突变或其遗传信息的传递有关。结论采用规范化治疗、严格掌握HP根除治疗的适应症及联合应用抗生素与铋剂或PPI将会避免HP耐药菌株的产生。     

幽门螺杆菌鞭毛蛋白B亚单位原核表达系统的构建及其产物的免疫性

目的　构建幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)鞭毛蛋白B亚单位 (flaB)原核表达系统 ,并鉴定其表达产物的免疫性。方法　采用PCR从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增全长flaB基因 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET32a flaB表达载体 ,以E .coliBL2 1DE3为表达宿主菌 ,用SDS PAGE检测重组蛋白 (rFlaB)的表达水平。采用Hp全菌抗体的Westernblot和兔抗rFlaB血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和抗原性。结果　所克隆的flaB基因与文献报道的核苷酸序列同源性为 96 .31%～ 97.73% ,氨基酸序列同源性高达 99.4 1%～ 10 0 %。构建的原核表达系统pET32a flaB E .coliBL2 1DE3的rFlaB产量为细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hp全菌抗体能识别rFlaB。rFlaB免疫家兔能获得高效价血清抗体。结论　已成功地构建了HpflaB高效原核表达系统 ,所表达的rFlaB有良好的免疫反应性和抗原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原     

幽门螺杆菌CrdR蛋白的原核表达

目的原核表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CrdR蛋白(即HP1365),以探讨其在酸适应中的调控机制。方法从H.pylori 26695标准株基因组DNA中PCR扩增hp1365基因,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,转化E.coli JM109,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pGEX-hp1365经双酶切、PCR和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为25 000,主要以包涵体形式表达,可与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合。结论原核表达了H.pylori CrdR蛋白,为进一步探讨其对酸信号的感应机制及其通过阻断酸信号的感应抗H.pylori感染的途径奠定物质基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因的克隆及其高效表达

目的克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因,构建原核表达载体,并进行高效表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UreB基因,双酶切后,与质粒pET-22b(+)连接,构建表达载体pET-22b(+)/UreB,分别转化E.coliBL21(DE3)、Origam(iDE3)和Rossetta(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经酶切及测序,证明幽门螺杆菌UreB基因的原核表达载体构建正确。3种重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,均可见相对分子质量为64000的目的蛋白条带,Rossetta(DE3)重组菌目的蛋白表达量最高,约占菌体蛋白的35%。Western blot结果表明,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了幽门螺杆菌UreB基因,并在大肠杆菌Rossetta(DE3)中获得了高效表达。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化

目的　对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序 ,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化。方法　克隆ureI基因 ,经测序正确后 ,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,获得Bacmid ureI质粒 ,转染Sf9细胞 ,采用Ni2 +螯合琼脂糖亲和层析纯化 ,经SDS PAGE和Westernblot鉴定。结果　克隆了ureI基因 ,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化 ,蛋白纯度达 85 %以上 ,并与 6 His单抗特异结合。结论　表达及纯化的ureI蛋白为进一步研究打下了基础     

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌热休克蛋白60基因（Hsp60）,并将它克隆到质粒 pET－22b（+）中进行核苷酸序列分析。方法 利用 PCR技术扩增 Hsp60,并将其定向插入 pET－22b（＋）载体中,通过 DNA序列分析仪进行核苷酸分析。结果DNA序列分析表明,所克隆的Hsp60基因序列与GeneBank公布的一致。结论 获得了序列正确的Hsp60基因,为其重组表达及相关研究奠定了基础。     

人组织激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达

目的 开发激肽释放酶基因工程产品,为开展基因治疗高血压奠定基础。方法 采用RT-PCR的方法合成人胰腺 cDNA,从中扩增出Kallikrein(KK)基因。经 XhoI和EcoR I双酶切后,连接到pET-28b(+)载体上,酶切鉴定后,进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果 将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳,与蛋白标准品比较,在相对分子质量31800处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。结论 已成功克隆并表达了人胰腺组织激肽释放酶基因,为进一步开发基因工程产品及进行基因治疗高血压研究打下了基础。     

幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS,为深入研究其功能及其在幽门螺杆菌耐酸机制中的作用奠定基础。方法以幽门螺杆菌菌株26695基因组为模板,采用PCR法扩增ArsS基因,插入pET-22b(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-22b(+)-ArsS,转化E.coliBL21(DE3),0.5mmol/LIPTG25℃诱导表达,并采用亲和层析与分子筛层析对重组蛋白进行纯化。结果重组原核表达质粒pET-22b(+)-ArsS经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组蛋白以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;分子筛层析图谱显示,在150mmol/LNaCl条件下,目的蛋白层析效果较好,纯化后的重组蛋白纯度可达95%以上,浓度约为10mg/ml。结论已成功原核表达并纯化获得了高纯度的ArsS蛋白。