严重急性呼吸道综合征冠状病毒2全长cDNA的构建新途径

目的 构建严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)全长cDNA,为SARS-CoV-2基因功能、药物筛选和安全减毒灭活疫苗株的研究提供重要工具,也为大基因组RNA病毒cDNA的构建提供新的方法.方法 结合In-...     

柯萨奇病毒A6型多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗柯萨奇病毒A6型(Coxsackie virus A6,CVA6)多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法将杆状病毒-昆虫细胞表达系统中共表达的CVA6病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯化后免疫日本大耳白兔,制备其多克隆抗体;用CVA6-R69-XY-2016、CVA10-R97-XY-2016、CVA16-V217-XY-2016、EV71-V54-XY-2016及CVA6 Gdula毒株分别感染人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞,体外中和试验及ELISA法检测中和抗体和结合抗体效价,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测抗体特异性。结果制备的兔抗CVA6 VLP多克隆抗体与CVA6-R69-XY-2016及CVA6 Gdula毒株的中和抗体效价均可达1 024,多克隆抗体仅与这2种病毒的结构蛋白VP1、VP2及VP3产生特异性反应,仅在这2种病毒感染的RD细胞中产生明显的绿色荧光;经ELISA分析,其结合效价达1×10⁷。结论成功制备了兔抗CVA6 VL...     

基于柯萨奇病毒-A5复制子的SARS-CoV-2自扩增RNA疫苗的构建及其免疫原性评价

目的 构建基于柯萨奇病毒-A5(Coxsackievirus-A5,CV-A5)复制子的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株(B. 1.617.2)自扩增RNA(self-amplifying RNA,saRNA)疫苗,并评价其免疫原性。方法 以含有CV-A5全长基因组序列的质粒为基础,通过In-fusion克隆将SARS-CoV-2Delta突变株S蛋白基因替换不同长度的CV-A5 P1结构蛋白基因,分别构建重组质粒pDelta-S10、pDelta-S5和pDeltaS1(融合多聚蛋白的S-VP1/2A酶切位点上游的氨基酸分别为10、5和1个)。通过线性化重组质粒体外转录获得3种RNA分子Delta-S10、Delta-S5和Delta-S1。将3种RNA分子分别转染HEK-293T细胞,Western blot分析S蛋白的表达,筛选出S蛋白表达量最高的RNA分子,qPCR检测其在HEK-293T细胞中的自扩增。将筛选出的Delta-S用脂质纳米颗粒包装后,...     

我国生物质能-碳捕集与封存技术应用潜力分析

生物质能-碳捕集与封存(BECCS)技术有望通过实现负排放,使全球温室气体穗定在较低甚至近零排放水平.为了评估BECCS在我国的应用及减排潜力,本文梳理了BECCS技术的发展现状,系统阐述了生物质资源量、技术成熟度、经济性和政府政策等因素对BECCS技术部署的影响,评估了基于农林废弃物燃烧发电、燃煤耦合生物质发电和生物...     

细胞嗜性差异的2株柯萨奇病毒A10型的构建与拯救

目的 以Vero细胞及人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞嗜性差异的柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)2个毒株为模板,分别构建感染性克隆,并完成病毒拯救,为CV-A10毒株的细胞嗜性研究奠定基础。方法 分别扩增Vero⁺/RD⁺及Vero^-/RD⁺细胞嗜性差异的CV-A10毒株基因组,在5′端引入T7启动子序列,3′端引入polyA尾及NotⅠ酶切位点。将扩增得到的基因组序列与线性化pBR322载体以无缝连接技术连接得到全长质粒,经线性化后分别与T7-RNA聚合酶表达质粒共转染RD细胞完成病毒拯救。通过病毒感染后细胞形态观察及间接免疫荧光试验,比较拯救毒株对Vero细胞嗜性的差异。结果 成功构建了Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株2种感染性克隆,并在RD细胞内完成病毒拯救,序列测定结果表明拯救毒株与亲本毒株序列一致。拯救毒株rCV-A10-010195能够有效感染Vero细胞并形成典型的细胞病变(cytopathic effect,CP...     

SARS-CoV-2非结构蛋白兔抗血清的制备及其在灭活疫苗质量监控中的应用

目的 制备SARS-CoV-2非结构蛋白1(non-structure protein 1,NSP1)兔抗血清,并用其检测SARS-CoV-2NSP1在灭活疫苗生产过程中的含量变化,为建立灭活疫苗纯度、工艺质量监控方法奠定基础。方法 选择带DE3的E. coli原核表达系统表达SARS-CoV-2 NSP1全长蛋白,纯化后免疫日本大耳白兔,共免疫6次,每次间隔14 d,采集全血,获得NSP1兔抗血清;以纯化的NSP1蛋白为抗原,Western blot法鉴定兔抗血清纯度,同时利用RD细胞表达NSP1-eGFP融合蛋白,裂解后作为抗原对NSP1兔抗血清进行特异性鉴定;以SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中1～4 d细胞裂解液及纯化后病毒颗粒为抗原,NSP1兔抗血清及M、S、E、N兔抗血清为一抗,Western blot法鉴定样品中抗原蛋白的含量变化。结果 成功表达带有GST标签的NSP1蛋白,并获得相应的兔抗血清,且抗原纯度较高;制备的兔抗血清能正确识别真核表达的NSP1-eGFP融合蛋白,并能鉴定灭活疫苗生产过程中蛋白含量的变化;灭活疫苗成品中不含NSP,疫苗纯度高;E蛋白与其他3种...     

柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备、纯化及鉴定

目的 制备柯萨奇病毒A2(Coxsackievirus A2,CV-A2)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并对其进行纯化及鉴定.方法 将CV-A2 P1和3CD)基因序列根据昆虫细胞偏好特性进行密码子优化并人工合成,分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(pPh)...     

有限土体下考虑土拱效应的非极限主动土压力解

以挡土墙后有限范围黏土为研究对象,考虑非极限状态下的土拱效应,并采用塑性上限理论求得的破裂面夹角和多滑裂面假设得到的侧向土压力系数变化规律,推导了有限土体的主动土压力解析式,该公式也可退化为半无限宽度的主动土压力公式。与模型试验相比,所提理论解与试验值取得了较好的一致性,证明了解析解的合理性。进一步参数分析表明:破裂面夹角随土体内摩擦角$\varphi$呈线性增长;随有限土体宽高比B/H减小而小幅增加;与地下室挡墙外摩擦角和内摩擦角的比值 $\alpha / \phi$ 呈正相关,而与基坑挡土墙外摩擦角和内摩擦角的比值$\delta / \varphi$呈负相关;在$\alpha / \varphi$大于或略小于$\delta / \varphi$时,破裂面夹角随位移比$\eta$单调增加,而当$\alpha / \varphi$远小于$\delta / \varphi$时,破裂面夹角随$\eta$增加先增大后减小。主动土压力随B/H减小而单调降低,其分布由子弹形逐渐转变为钟形;主动土压力值与$\delta / \varphi$、$\alpha / \varphi$和$\varphi$都呈负相关,且随$\delta / \varphi$与$\varphi$的增加非线性逐渐增强。