甲基营养型大肠杆菌构建策略的研究进展

利用微生物细胞工厂实现原料转化和产品合成是绿色生物制造的核心。然而,当前生物制造仍以富含糖类的谷物粮食为主要原料,存在“与民争粮”的争议,亟需开发非粮原料。甲醇作为煤化工产业中的重要产品,具有来源广、价格低、还原性强等优势,有替代粮食原料的潜力。天然甲基营养菌可利用甲醇生产单细胞蛋白和各种氨基酸,但存在理论收率低、遗传改造工具不足等缺点。随着合成生物学的发展,以大肠杆菌等模式生物作为底盘细胞构建人工甲基营养菌,实现甲醇到各种化学品的生产已成为研究热点。本文总结了多种甲基营养型大肠杆菌的构建策略,明确了影响天然路径代谢的关键因素与代谢过程中的重要中间产物,概括了各种天然路径在大肠杆菌中的优化策略与人工新路径的构建方法,并对工程菌株的优化提出了展望。     

有机酸对Actinbacillus succinogenes厌氧发酵过程的抑制作用

通过在发酵培养基中分别添加不同浓度的丁二酸、甲酸和乙酸,考察了3种有机酸对茵体生长及代谢产物积累的影响.结果表明,在初始葡萄糖浓度为40 g/L厌氧发酵产丁二酸体系中,甲酸抑制作用最强,乙酸次之,丁二酸无明显抑制作用.当甲酸和乙酸总浓度超过13.70 g/L时,菌体开始衰亡.利用膜循环生物反应器在发酵过程甲酸和乙酸总浓度达到13.70 g/L时移出部分抑制性代谢产物,有效地降低了有机酸对A.succinogenes NJ113生长代谢的抑制作用,丁二酸生产强度达1.70 g/(L·h),比分批发酵提高了17.2%.     

产琥珀酸大肠杆菌工程菌株的构建

大肠杆菌在厌氧条件及不额外添加电了受体的条件下可利用葡萄糖进行混合酸发酵,主要产物为甲酸、乙酸和乙醇,丁二酸及乳酸含量较低.为减少副产物的生成,使更多的代谢流流向丁二酸,本研究拟失活厌氧条件下甲酸、乙酸及乳酸主要生成途径相关的酶(乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶).借助Red重组系统和位点特异性重组技术,无痕敲除了野生大肠杆菌W3110染色体上编码2个酶的基因pfl和ldh,构建了1株pfl和ldh双突变重组菌JM1307(△pfl △ldh),并引入PYC前后对比实验表明:JM1307(pTrc99a-pyc)较出发菌株解除了生长抑制,在8g/L初糖条件下,发酵48h,菌体密度可提高全OD6002.5,产物主要为丁二酸(2.8g/L),乙酸含量很低,无甲酸、乳酸生成.     

微生物絮凝剂产生菌NX-2的筛选和合成条件的研究

从土壤中筛选分离到 1株高效絮凝剂产生菌NX 2 ,鉴定为枯草芽孢杆菌 (Bacillussub tilis)。在含谷氨酸和葡萄糖的培养基中培养 ,其发酵产物粘度高 ,对高岭土、活性炭等固体悬浮颗粒具有显著的絮凝作用 ,而缺少谷氨酸和额外碳源则不能产生絮凝活性。NX 2培养并产生絮凝活性的碳源可采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉和果糖 ,氮源采用酵母膏、蛋白胨等有机氮源或铵盐等无机氮源。通过核磁共振等手段对分离提纯的样品进行结构表征 ,鉴定其为γ 聚谷氨酸。     

重组大肠杆菌厌氧发酵产丁二酸培养条件的优化

采用Plackett-Burman设计法(Plackett-Burman,PB)对影响Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵生产丁二酸的11个因子进行了筛选。结果表明,影响该菌厌氧发酵生产丁二酸的主要影响因子为乙酸钠、MgCO3、接种量、诱导剂IPTG加入时间和发酵周期。在此基础上采用响应曲面法(Response Surface Methodology,RSM)对这5个因子的影响进行了研究,得出多元二次回归方程拟合的5种因素与丁二酸产量间的函数关系,并根据优化结果与实验验证,当初始葡萄糖浓度为22 g/L,乙酸钠1 g/L,MgCO317 g/L,接种量10%,IPTG初始时加入,发酵周期76 h时,丁二酸产量从原始发酵培养条件下的11.84 g/L提高到15.64 g/L,收率从53.8%提高到71.1%。     

厌氧发酵有机酸体系中NAD+和NADH测定方法的建立

建立一种酶法高效测定厌氧发酵有机酸体系中NAD 和NADH的方法。利用酶循环机理,以1.0 mol/L Bicine buffer(pH8.0)、纯乙醇、40 mmol/L EDTA(pH8.0)、4.2 mmol/L MTT、16.6mmol/L PES和50μL的乙醇脱氢酶作为混合反应体系,采用紫外可见分光光度计在570 nm处测定吸光值变化情况,能将发酵体系中的NAD 和NADH准确定量,检出限分别为1.3×10-6 mol/L和5.9×10-6 mol/L,回收率分别在94%～98%和96%～101%范围内。能够快速、精确测定厌氧发酵体系中的NAD 和NADH含量,对于指导厌氧发酵体系辅酶代谢调控分析具有重要意义。     

产琥珀酸放线杆菌固定CO_2制备丁二酸

在富含CO2的厌氧环境下,产琥珀酸放线杆菌NJ113固定CO2合成丁二酸作为主要代谢终产物。在5 L发酵罐探讨了培养条件对产琥珀酸放线杆菌NJ113固定CO2制备丁二酸的影响。考察了CO2供体形式、通气量、搅拌转速、培养温度和pH值对产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵过程中CO2固定速率以及丁二酸产率的影响。结果表明,选择CO2气体作为CO2供体,CO2通气量为0.75 L/min,搅拌转速达到200 r/min,培养温度为37℃,NaOH调节pH值为6.6,可增加细胞内可利用的CO2。在此优化条件下培养,CO2固定速率达到0.6 g/(L.h),丁二酸产率达到1.61 g/(L.h)。     

有氧生长调控策略对大肠杆菌工程菌厌氧发酵生产丁二酸的影响

研究了调控工程菌有氧生长的葡萄糖补料策略对既得细胞厌氧发酵的影响。通过摇瓶分批厌氧发酵筛选出最佳转厌氧时机,为菌体以比生长速率0.07h-1生长至OD600=30,此时发酵罐上转厌氧发酵得到丁二酸浓度94.2g/L,生产能力1.76g(/L.h),葡萄糖收率105%。     

碱性树脂分离丁二酸性质研究

针对厌氧发酵体系,选用碱性阴离子交换树脂对丁二酸进行了吸附分离研究。通过静态吸附实验筛选得到了201强碱和D301弱碱树脂,其吸附量分别为150mg/g和300mg/g。分别测定了上述2种树脂对丁二酸的吸附速率曲线和吸附等温线,讨论了吸附平衡的主要影响因素。结果表明:在pH4～5条件下,强碱201树脂具有较好的吸附性能,确定了201树脂对丁二酸的最适操作条件为固液比为1(g)∶20(mL),pH4.14。同时,对201树脂的动态吸附、洗脱特性进行了初步的研究。     

利用废弃碳资源生产鼠李糖脂的研究进展

鼠李糖脂是微生物合成的一类糖脂类生物表面活性剂,具有优异的表面活性、理化性质和广阔的应用前景。铜绿假单胞菌是鼠李糖脂生产的主要发酵菌株,能够以多种水溶性碳源或疏水性碳源为底物发酵生产鼠李糖脂。当前,废弃碳资源导致的浪费和污染问题日益严峻,基于鼠李糖脂的特性与生产菌株的底物偏好性,以废弃碳资源为原料生产鼠李糖脂具有很大的发展潜力。本文分别介绍以废油脂(含油废水、食品加工废油和餐厨废油)、含糖废弃物(含糖的食品加工副产物、含糖果蔬废弃物和木质纤维)和废塑料等高聚废弃物为原料合成鼠李糖脂的研究进展,重点总结了不同底物和生产菌株对鼠李糖脂生产的影响。通过分析废弃碳资源当前利用现状,发现繁多的种类、较低的分类程度和难降解的组分是限制以废弃碳资源作为底物生产鼠李糖脂进一步发展的主要因素,并提出以废弃碳资源生产鼠李糖脂的未来发展方向。