纤维素酶EGA基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其产物性质研究

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一种高效的外源蛋白表达菌株,能将目的蛋白分泌到细胞外的培养基中.从福寿螺胃液共生菌株Bacillus sp.Strain AC-1基因组中克隆纤维素酶EGA的基因序列,利用基因工程技术构建纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌表达载体pAUsp-ega.该载体含有一个强启动子和一段信号肽,经淀粉诱导能表达外源蛋白.以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失型菌株WB700为宿主菌,表达得到的重组纤维素酶EGA以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物得到的培养基上清酶活力达到1 120 U/L.该纤维素酶在pH 6.0表现最大水解活力,最适反应温度为60℃,在酸性条件下稳定性良好,具有较好的应用前景.     

醛糖还原酶cDNA的克隆和表达

醛糖还原酶能促使葡萄糖转化成山梨醇,是多元醇代谢通路的限速酶,与糖尿病并发症的发生和发展有密切关系.用RT-PCR扩增醛糖还原酶基因,将扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b(+)-AR.经PCR、双酶切和序列测定鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定后,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得重组蛋白AR-(His)6.紫外分光光度法对AR-(His)6进行酶活检测,其比活力为0.45 U/mg,为下一步筛选具有抑制醛糖还原酶活性的化合物及开发有临床应用价值的醛糖还原酶抑制剂提供参考.     

福寿螺多功能纤维素酶（EGXA）的结构功能研究

利用点突变的方法构建了E332A、E332S和D1290Q的多功能纤维素酶(EGXA)的突变体,研究了在甲醇酵母中重组表达的突变体的酶学性质.结果表明:E332可能是该酶的活性必需基团,而D290Q突变体的外切葡聚糖酶及内切木聚糖酶活性均提高2～3倍,对EGXA研究及其应用提供了理论依据.     

福寿螺多功能纤维素酶EGXA在酿酒酵母中的表达

研究在酿酒酵母中表达福寿螺内源性纤维素酶基因egxa cDNA。结果显示：重组酶水解对一硝基酚纤维二糖苷（pNPC）、微晶纤维素（sigmacell）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）以及Oatspelt的木聚糖（xylan from oat spelt，麦木聚糖）等4种底物的活力分别为1．25，84，70和196U／L，并发现了天然信号肽，酵母性因子信号肽（MRl）对重组酶表达的影响。     

响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素G酰化酶

利用响应面法优化重组枯草芽孢杆菌pAUB-BmPGA／BS168发酵生产青霉素G酰化酶的条件。通过Plackett-Burman设计法对碳源、氮源、无机盐、温度等19个因素对发酵产青霉素G酰化酶的影响进行评价。筛选出发酵温度和酵母膏为影响产酶的显著因素。采用了中心组合设计实验对两种显著影响因素进行了优化,应用响应面分析确定了显著因素的最佳水平。结果表明,当温度为34℃,酵母膏为8．8g／L时,最终的酶活达到28．2U／mL,比初始发酵条件提高了1．19倍。在最佳条件利用15L的发酵罐对重组枯草芽孢杆菌进行扩大培养,最终酶活可达51．0U／mL,相对于摇瓶发酵又有大幅度的提高。     

RNA结合蛋白Vigilin在翻译水平上对雌激素受体ER—beta的调控研究

Vigilin是一个由14个连续的KH结构域组成的RNA结合蛋白。它可以通过与mRNA结合调控mR—NA的翻译后表达水平,并能够结合脂蛋白。本实验室此前的实验中发现Vigilin参与了对雌激素信号传导通路的调控,为详细研究其调控机制,文章通过凝胶阻滞实验证明了Vigilin能在体外结合于雌激素受体3’非翻译区（ER-beta3’UTR）。借助双荧光素酶报告基因实验发现,高表达Vigilin可以提高雌激素信号通路中的重要受体ER-beta的翻译效率。利用激光共聚焦显微镜和荧光蛋白定位实验,发现Vigilin在细胞内大量定位于p-body中。通过上述实验证明了Vigilin能够通过结合ER-beta3’UTR调控ER-beta的表达量,参与了细胞内雌激素信号传导通路。由于ER-beta是雌激素信号传导中非常重要的受体,因此该研究具有重要的意义。     

响应面法优化重组枯草芽孢杆菌生产纤维素酶EGA的研究

通过响应面优化法（response surface methodology,RSM）对分泌表达纤维素酶EGA重组枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化。利用Plackett-Burman实验设计对淀粉、酵母粉、蛋白胨等8个因素对枯草芽孢杆菌产纤维素酶EGA的显著影响与否进行评估分析,筛选得到淀粉、酵母粉和MgSO4·7H2O为3个显著影响的因素,再利用Box-Behnken实验设计对这3个因素进行进一步优化,确定最佳培养基的配比为淀粉21g/L,酵母粉11.26g/L,蛋白胨25g/L,MgSO4·7H2O 1.52g/L,KH2PO40.395g/L,NaCl 3.25g/L,CaCl20.1g/L,FeSO4·7H2O 0.005g/L。在最优条件下,利用小型发酵罐对重组菌进行扩大培养,其最高酶活力达到1 264U/L。     

响应面法优化重组毕赤酵母表达纤维素酶EG27的研究

为优化重组毕赤酵母表达动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件,在单因素实验基础上,以培养基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量为自变量,EG27的酶活为响应值,采用Box-Behnken设计的方法,研究各自变量及其交互作用对毕赤酵母产EG27收率的影响。利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对毕赤酵母产动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件进行优化,确定了最佳的培养基条件。在该培养条件下,获得最高产酶量为354U/L。     

响应面法优化重组毕赤酵母表达纤维素酶EG27的研究

为优化重组毕赤酵母表达动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件,在单因素实验基础上,以培养基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量为自变量,EG27的酶活为响应值,采用Box-Behnken设计的方法,研究各自变量及其交互作用对毕赤酵母产EG27收率的影响。利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对毕赤酵母产动物内源性纤维素酶EG27的培养基条件进行优化,确定了最佳的培养基条件。在该培养条件下,获得最高产酶量为354U/L。     

免疫抑制剂FK506对乳腺肿瘤细胞株的体外作用

利用FK506(Tacrolimus)对乳腺肿瘤细胞株MCF-7进行体外作用研究,发现FK506可以抑制其增殖.MTT检测结果显示,24 h与48 h的半抑制浓度基本一致,说明其在较短时间内即可发挥有效作用.细胞形态学观察以及细胞染色表明,FK506没有诱导细胞凋亡,而是阻抑了细胞的分裂.进一步经双向电泳(2-DE)蛋白质表达图谱和MALDI-TOF-TOF质谱分析,发现有17种蛋白在FK506处理细胞前后发生明显的表达量上的差异,并进一步从中鉴定出12种蛋白.这些蛋白,按其功能主要分为两大类:一类参与调节细胞骨架的装配与运输,从而影响到神经发育与细胞分裂;另一类,与基因存在密切的相互作用,参与了其复制、修复、转录调节以及翻译后蛋白的折叠,从而影响细胞分裂周期与凋亡.这些差异蛋白为明确FK506抑制细胞增殖的作用机制提供了基础,同时,FK506可以抑制乳腺肿瘤细胞增殖这一功能,也为其成为临床治癌药物提供了可能性.