圆弧青霉BD26碱性脂肪酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。     

编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ的基因克隆与表达研究

采用RT-PCR法,以草菇Volvariella.volvacea V23总RNA为模板,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egⅠ)的cDNA序列。测序结果表明,它全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1～23位氨基酸为信号肽,第24～389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第5家族。PCR扩增成熟肽编码基因并将其插入到分泌型表达载体pPIC9K中,重组载体经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到了1株高产中性内切葡聚糖酶Ⅰ的工程菌株P.pastoris-EGⅠ1。SDS-PAGE检测表明,重组中性内切葡聚糖酶Ⅰ分子质量约为42 ku。在甲醇诱导96h时,酶活达到3 698 U/mL。     

宇佐美曲霉木聚糖酶粗酶性质研究

本文对宇佐关曲霉(Asp．usamii)产木聚糖酶的产酶进程进行了分析，28℃固态静置培养72h，酶活力可达到7442IU／g干曲。粗酶酶学性质研究表明：该木聚糖酶的最适反应温度50℃，低于50℃时较稳定；酶的最适pH4．6，pH稳定范围为pH5．0-10．0。Ca^2 对酶有激活作用，而Mn^2 、Mg^2 、Ba^2 则具有强烈的抑制作用。     

里氏木霉固体发酵生产纤维素酶的研究

里氏木霉突变株RM—27是一株高产纤维素酶生产菌,采用固体发酵,发酵144h(培养温度29℃),其滤纸酶活和β—葡萄糖苷酶活分别为600和115mg葡萄糖/gDMh。本试验系统研究了各种营养成份和培养条件对RM-27菌株产纤维素酶的影响。最适发酵培养基:稻草杆或小麦杆70g、麸皮30g、硫酸铵3.0g、玉米浆2.0g,加水200ml,自然pH。酶反应最适温度和pH分别为60—65℃与pH5.0。酶pH稳定性较好,在pH3.0—7.0范围内处理3h,残余酶活力在89％以上,该酶经50℃处理30min,剩余酶活力为85.6％。     

定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性

为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly~(21)。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly~(21)的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E. coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E. coli/Aoxyn11A~(G21I))。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11A~(G21I)表达一种由Ile~(21)替换了Gly~(21)的突变酶AoXyn11A~(G21I)。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11A~(G21I)在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

乙酰木聚糖酯酶协同木聚糖酶降解木聚糖的研究

探讨了宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)乙酰木聚糖酯酶和第10、11家族木聚糖酶之间的协同作用。利用作者所在实验室构建保藏的3株工程酵母Pichia pastoris GS115/Auaxe、GS115/Auxyn11A和GS115/Auxyn10A进行甲醇诱导发酵,分别获得重组乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶。在木聚糖酶最适p H、40℃、料液质量体积比1 g∶60 m L、水解2 h的条件下分别研究了不同加酶量作用于小麦麸皮时生成的还原糖量。结果表明,乙酰木聚糖酯酶与第11家族木聚糖酶有更好的协同作用,并在添加量比(酶活力比)为5∶1时所测协同效果最好,还原糖生成量较木聚糖酶单独作用增加了46%。因此,在乙酰木聚糖酯酶的作用下,木聚糖上乙酰基的去除,对提高木聚糖酶对木聚糖的水解效率具有重要作用。     

定点突变提高菜豆环氧水解酶的对映选择性

为了提高菜豆环氧水解酶(PvEH1)催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映选择性,利用定点突变构建了PvEH1~(W102L)、PvEH1~(P137K)及PvEH1~(I151V)三种突变体,分别研究了突变体全细胞动力学拆分rac-pCSO的催化特性,优化了PvEH1W102L动力学拆分rac-pCSO的初始底物浓度及反应时间,通过分子模拟分析了PvEH1~(W102L)对映选择性提高的机理。结果表明,最优突变体PvEH1~(W102L)的E值为25.5,相对酶活为212.6%,分别是PvEH1的11.6倍与2.1倍;PvEH1~(W102L)动力学拆分150 mmol·L~(-1) rac-pCSO,反应4 h后,可获得(R)-pCSO(产率为45.62%,ees为96.30%)和(R)-对氯苯基乙二醇(产率为50.91%,eep为90.26%)。分子模拟结果分析表明,PvEH1的102位色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)降低了酶与(R)-pCSO的结合能力,从而提高了PvEH1~(W102L)对pCSO的对映选择性。     

饱和突变改善米曲霉11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae)11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性,作者采用全质粒PCR方法对AEx11A基因(AEx11A)中编码Thr~(98)、Asn~(100)、Val~(124)、Pro~(129)和Ile~(132)的密码子实施饱和突变,构建饱和突变文库。以木聚糖酶的酶活性为指标,采用DNS法从文库中筛选出酶活性提高30%以上的转化子。对其中酶活性提高最明显的两个位点Thr~(98)和Val~(124)实施迭代饱和突变,筛选出最优突变子AEx11~(AT98D-V124Q),其纯化后的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍。此外,突变酶AEx11A~(V124T)的热稳定性较AEx11A有一定的提高,其余2个突变酶的温度特性与AEx11A差异不大。     

黑曲霉固态培养生产纤维素酶的研究

黑曲霉突变株ＤＭ－１是一株产纤维素酶菌株，其中β葡萄糖苷酶活性特别高。采用粗纤维原料固体培养，发酵９６小时（培养温度３１℃），其滤纸酶活和β葡萄糖苷酶活分别为９５和１２００ｍｇ葡萄糖／ｇＤＭｈ。本试验系统研究了各种营养成份和培养条件对ＤＭ－１菌株产纤维素酶的影响。最适发酵培养基为：稻草杆（或麦杆）∶麦麸为６０∶４０、硫酸铵３．０、硫酸镁０．３、玉米浆３．０，加水２００％，自然ｐＨ；环境湿度８５％－９０％。酶反应最适温度和ｐＨ分别为５５℃－６０℃和ｐＨ５．０。酶ｐＨ稳定性较好，在ｐＨ３．０－８．０范围内处理１小时，残余酶活力在８５％以上，该酶经５５℃处理３０ｍｉｎ，剩余酶活力为８６．０％。