黑曲霉液体发酵纤维素酶的研究

在黑曲霉ＤＭ—１液体深层发酵所产纤维素酶系中，β－葡萄糖苷酶活性特别高。系统研究了ＤＭ—１菌株的摇瓶产酶条件及２５Ｌ发酵罐发酵工艺。２５Ｌ发酵罐试验结果表明，在通风量０．４～１．０ｖｖｍ、搅拌转速２５０～５００ｒ／ｍ、发酵温度３１℃及控制发酵液ｐＨ在４．０左右的条件下，发酵１０４小时，其β－葡萄糖苷酶活和ＣＭＣ分别为３３０和２４１ｍｇ葡萄糖／ｍｌ。发酵滤液经硫铵盐析沉淀、过滤或离心及干燥等过程得固体纤维素干酶粉。其中β－葡萄糖苷酶活为１３５００ｍｇ葡萄糖／ｇ，平均收率８０．２％。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的产酶条件

研究了培养基组分和培养条件对黑曲霉菌株Aspergillusniger LW-1固态发酵产β-甘露聚糖酶的影响。在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计确定的最佳产酶培养基组成和培养条件：麸皮与豆饼粉质量比为7.5∶2.5（g/g）,其它物质相对于固体物料的质量分数分别为魔芋粉4%,KH2PO40.3%,玉米浆5%,CaCl20.1%,MgSO40.1%,（NH4）2SO41%,液固质量比为1.5∶1,自然pH;32℃静置培养84h,期间翻曲1次。最高酶活可达24879IU/g。     

仿生鲶鱼抗菌肽编码序列的设计及克隆

人工合成的仿生鲶鱼抗菌肽DNA序列，经聚合酶链式反应(PCR)扩增后得到带有不同限制性酶切位点的序列XH1、XH2、XH3．将此基因克隆至载体pGEX-5X-3，成功构建了三串联的重组质粒．测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃IPTG诱导，获得高效表达，SDS—PAGE扫描分析表明，融合蛋白可达细菌全蛋白总量的30％，融合蛋白以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞中．     

二氢杨梅素生物功效的研究

本实验采用《保健食品检验与评价技术规范》提供的方法,研究了从显齿蛇葡萄茎叶中提取的黄酮类化合物二氢杨梅素的生物功效。实验结果显示:二氢杨梅素毒性很小,其大鼠口服灌胃的最大耐受量为5.0g/kg。二氢杨梅素小鼠灌胃30d后能有效地阻止乙醇导致的肝脏GSH耗竭和MDA升高,能降低TG含量,减轻肝细胞脂肪变性等,该结果表明:二氢杨梅素有较强的抗氧化能力,还能够有效地预防乙醇性肝损伤。因此,二氢杨梅素作为天然的抗氧化剂具有良好的开发前景。     

宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究通过RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆了编码阿魏酸酯酶A的成熟肽cDNA(AusfaeA),构建重组表达质粒pPIC9K-AusfaeA,将其经SacⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/AusfaeA,用甲醇诱导表达重组阿魏酸酯酶(reAusFaeA)。SDS-PAGE显示,纯化后的reAusFaeA为单一条带,其表观相对分子质量为36 000;以阿魏酸甲酯为底物,经高效液相色谱法测定,该酶的酶活为29.4 U/mg;reAusFaeA的最适反应温度为45℃,并在45℃以下稳定;最适反应pH为5.0,在pH 4.0~6.0范围内稳定;多数测定的金属离子及EDTA对该酶的活性影响不大。结果表明在P.pastoris中成功实现了AusfaeA的异源表达,该重组酶优良的酶学性质表明其具有较大的工业应用潜力。     

米曲霉木聚糖酶N端引入二硫键对其热稳定性的影响

为提高源自米曲霉Aspergillus oryzae 11家族木聚糖酶(AoXyn11A)的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对野生型酶AoXyn11A和一种超耐热酶EvXyn11TS的N端氨基酸残基序列进行同源比较,在野生型酶N端引入一个二硫键,获得突变酶AoXyn11AM。野生型酶和突变酶的热稳定性通过同源建模和分子动力学模拟分析评估后,其基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析温度对表达产物酶活性的影响。结果表明:突变酶的最适温度由野生型酶的55℃提高至60℃;在50℃和55℃保温30 min,突变酶保留94%和45%保温处理前的酶活性,分别较野生型酶(62.5%和1.4%)有大幅度的提高。突变酶在保留了野生酶其它优良性质的基础上,提高了热稳定性,具有潜在的工业应用价值。     

茶树菇多糖的初步纯化及其毒理学初步评价

采用Sevage法去除游离蛋白质，H2O2脱色、蒸馏水透析去除无机盐等方法对茶树菇菌丝体多糖和发酵液多糖进行初步纯化，经真空干燥后获得白色粉末。急性毒性试验表明，在大剂量腹腔注射菌丝体多糖和发酵液多糖的情况下。未出现小鼠死亡，也未有明显毒性反应，说明茶树菇多糖无毒性或毒性很小，其最大安全剂量在200ms／ks以上。     

定点突变提高菜豆环氧水解酶的对映选择性

为了提高菜豆环氧水解酶（PvEH1）催化对氯环氧苯乙烷（pCSO）的对映选择性,利用定点突变构建了PvEH1^W102L、PvEH1^P137K及PvEH1^I151V三种突变体,分别研究了突变体全细胞动力学拆分rac-pCSO的催化特性,优化了PvEH1^W102L动力学拆分rac-pCSO的初始底物浓度及反应时间,通过分子模拟分析了PvEH1^W102L对映选择性提高的机理。结果表明,最优突变体PvEH1^W102L的E值为25.5,相对酶活为212.6%,分别是PvEH1的11.6倍与2.1倍;PvEH1^W102L动力学拆分150 mmol·L^-1 rac-pCSO,反应4 h后,可获得（R）-pCSO（产率为45.62%,ee_s为96.30%）和（R）-对氯苯基乙二醇（产率为50.91%,ee_p为90.26%）。分子模拟结果分析表明,PvEH1的102位色氨酸（W）突变为亮氨酸（L）降低了酶与（R）-pCSO的结合能力,从而提高了PvEH1^W102L对pCSO的对映选择性。     

β-甘露聚糖酶固态发酵的产业化生产技术

在黑曲霉LW-1-9菌株三角瓶固态发酵试验的基础上,经曲盘(Φ 20.0 cm × 5.0 cm)固态发酵试验,放大到30.m3固态发酵罐(Φ 4.5 m × 2.0 m)的产业化生产规模.固态发酵基料(其中:麸皮700～800 kg,豆饼粉或菜籽饼粉200～300 kg)总量为1 000 kg/批次,料水质量比1: 1 8～2 0,自然pH,并添加魔芋粉3%～5%,玉米浆3%～5%,(NH4)2SO4 1%～1.5%,CaCl2 0.05%0.1%,MgSO4 0.05%～0.1%,KH2PO4 0.3%～0.5%(质量分数,相对于基料);经灭菌、接种后,于32～36 ℃间断通风培养72～84 h,期间分别于第20-24小时和第36-40小时各翻曲1次,并同时补加无菌水180～200 kg.在上述发酵工艺条件下,LW-1-9菌株产业化生产β-甘露聚糖酶,活性可达每克干曲26 725～29 218 IU.     

木聚糖酶EvXyn11TS N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析

系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11~(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11~(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11~(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11~(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。