β-甘露聚糖酶固态发酵的产业化生产技术

在黑曲霉LW-1-9菌株三角瓶固态发酵试验的基础上,经曲盘(Φ 20.0 cm × 5.0 cm)固态发酵试验,放大到30.m3固态发酵罐(Φ 4.5 m × 2.0 m)的产业化生产规模.固态发酵基料(其中:麸皮700～800 kg,豆饼粉或菜籽饼粉200～300 kg)总量为1 000 kg/批次,料水质量比1: 1 8～2 0,自然pH,并添加魔芋粉3%～5%,玉米浆3%～5%,(NH4)2SO4 1%～1.5%,CaCl2 0.05%0.1%,MgSO4 0.05%～0.1%,KH2PO4 0.3%～0.5%(质量分数,相对于基料);经灭菌、接种后,于32～36 ℃间断通风培养72～84 h,期间分别于第20-24小时和第36-40小时各翻曲1次,并同时补加无菌水180～200 kg.在上述发酵工艺条件下,LW-1-9菌株产业化生产β-甘露聚糖酶,活性可达每克干曲26 725～29 218 IU.     

木聚糖酶EvXyn11TS N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析

系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11~(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11~(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11~(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11~(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。     

N-端置换提高木聚糖酶AoXyn11A的耐热性

为提高米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶家族(GHF)11木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其N-端置换为来源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同一家族耐热木聚糖酶pXYL11的对应区域。基于木聚糖酶耐热性的理性设计,采用大引物PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)的5′-端DNA片段置换为pXYL11人工合成基因(xyn11PM)的对应片段,构建出杂合木聚糖酶ATX11A基因(ATx11A)。分别将Aoxyn11A和ATx11A在毕赤酵母GS115中进行了表达,并分析了重组表达产物AoXyn11A和ATX11A的温度特性。结果表明:ATX11A的最适温度T_(opt)由AoXyn11A的50℃提升至65℃,在60℃的半衰期t_(1/2)~(60)为55 min,较AoXyn11A延长了41.3倍;ATX11A在55℃处理3 h保留60%以上的酶活性,而AoXyn11A处理15 min酶活性完全丧失。本研究通过N-端置换显著改善了AoXyn11A的温度特性。     

宇佐美曲霉木聚糖酶的纯化和性质

采用缓冲液浸提、硫酸铵盐析、Phenyl—Sepharose CL-4B疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等分离纯化手段，从宇佐美曲霉E001固态发酵曲中分离出木聚糖酶组分，再经DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析进一步纯化，获得了两种电泳纯木聚糖酶XynⅠ和XynⅡ．分别采用SDS-PAGEG-75凝胶过滤层析测得XynⅠ、XynⅡ相对分子质量，两种酶均为单体蛋白质；等电聚焦电泳测得两种酶的等电点（pI）；测定了XynⅠ、XynⅡ的酶动力学常数；序列测定XynⅡN末端15个氨基酸残基的．     

魔芋葡甘露聚糖的酶水解工艺条件

研究了利用黑曲霉(Aspergillus niger)E-56菌株所产高活力β-甘露聚糖酶水解魔芋葡甘露聚糖的工艺条件.在单因素试验的基础上,进一步通过正交试验确定酶法制备甘露低聚糖的最佳工艺条件为:魔芋胶质量浓度240 g/L(去离子水配制),加酶量为120 U/g,50 ℃酶解8 h.在该工艺条件下,酶解液中葡甘露低聚糖的平均聚合度(DP)在1.8～1.9范围内.     

碱性脂肪酶的高效液相色谱和质谱分析

以常压层析系统纯化的碱性脂肪酶为出发蛋白,采用高效反相色谱对其进一步分离纯化,达到N末端氨基酸测序及肽谱分析所需的纯度.用电喷雾质谱测得脂肪酶的相对分子质量为27 217±1.对该脂肪酶的胰蛋白酶水解条件及肽段的相对分子质量等进行了研究.     

米曲霉木聚糖酶N端引入二硫键对其热稳定性的影响

为提高源自米曲霉Aspergillus oryzae 11家族木聚糖酶(AoXyn11A)的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对野生型酶AoXyn11A和一种超耐热酶EvXyn11TS的N端氨基酸残基序列进行同源比较,在野生型酶N端引入一个二硫键,获得突变酶AoXyn11AM。野生型酶和突变酶的热稳定性通过同源建模和分子动力学模拟分析评估后,其基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析温度对表达产物酶活性的影响。结果表明:突变酶的最适温度由野生型酶的55℃提高至60℃;在50℃和55℃保温30 min,突变酶保留94%和45%保温处理前的酶活性,分别较野生型酶(62.5%和1.4%)有大幅度的提高。突变酶在保留了野生酶其它优良性质的基础上,提高了热稳定性,具有潜在的工业应用价值。     

绿色木霉WL 0422高产纤维素酶的研究

250 mL三角瓶装8.0 g基料(麸皮稻草粉=4.0 g4.0g),(NH4)3PO42.0%,KH2PO4 0.3%,CaCl2 0.1%,MgSO4·7H2O 0.1%,CMC-Na 3.0%(均相对于基料),料水比11.3～1.4,自然pH;于32℃培养108h,期间翻曲2次,CMC酶活力2 488 IU/g干曲.曲盘发酵的料水比改为11.6,其余组分同锥形瓶优化发酵培养基;于32℃培养96 h,期间翻曲2次,CMC酶活力可达2 215 IU/g干曲.     

定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质

基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A~(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly~(320)的密码子GGT突变为Asp~(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A~(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A~(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A~(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A~(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A~(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly~(320)突变为Asp~(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。