全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serumalbumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性。方法在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠激酶酶切位点,从该质粒中扩增6His-EK-PTH(1-34)-HSA基因,插入pPIC9K载体中,构建重组表达质粒pPIC9K-6His-EK-PTH(1-34)-HSA,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切,获得全长的PTH(1-34)-HSA融合蛋白;检测融合蛋白对UAMS-32P成骨细胞增殖活力、碱性磷酸酶活性以及RANKL和OPG基因转录水平的影响。结果重组表达质粒经测序证实构建正确;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白相对分子质量约70 000,可与PTH抗体和HSA抗体特异性结合,发酵获得的融合蛋白的浓度为200 mg/L;纯化的融合蛋白可与抗PTH、HSA和6His标签抗体特异性结合,经肠激酶酶切后,该蛋白失去了与6His抗体反应的能力,保持了与PTH和HSA抗体结合的能力;酶切后的全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白保持了PTH的生物活性,能促进UAMS-32P成骨细胞的增殖活力,提高细胞的碱性磷酸酶的活性,上调细胞RANKL基因的转录水平以及抑制OPG基因的转录水平。结论成功在毕赤酵母中表达了全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白,有望提高PTH的成药性。     

重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生

为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21(DE3)中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH。SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa。酶学性质分析表明:该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0~8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg;Zn2+对其有明显激活作用;该酶对NADP+的亲和力大于NAD+且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0%,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力。     

不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响

以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm~27和Auman5A-R-cbm~27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)~(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。     

β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达

为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5A~(loop/H321G))克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5A~(loop/H321G),并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5A~(loop/H321G))的转化子GG799/AuMan5A~(loop/H321G),其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5A~(loop/H321G)的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5A~(loop/H321G)所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5A~(loop/H321G)在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。     

碱性脂肪酶在洗衣粉中稳定性的研究

本文对各种碱性脂肪酶在洗衣粉中的稳定性做了系统的研究，更加全面深入地了解各种碱性脂肪酶的特性，为碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用提供了理论依据。     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的28SrRNA和18SrRNA条带。根据PG37所产碱性脂肪酶（Lip PC）N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在3'端具有poly(A）等所提供的生物信息，采用RT－PCR技术扩增了Lip PC成熟肽和3'非编码区的cDNA片段，并将该PCR产物直接克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明，Lip PC含有258个氨基酸残基，其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用ClonTech公司的Smart^TM PCR cDNA文库构建试剂盒，扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段，从而完成了Lip PC完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中，SDSPAGE检测结果表明，大肠杆菌BL21所表达的GST－Lip PC融合蛋白质分子质量约为53ku。     

平板扩散法粗略确定碱性脂肪酶的活性

通过对圆弧青霉PG3 7所产碱性脂肪酶活性测定方法的研究和比较 ,建立了一种快速、直观、灵敏的固体琼脂平板脂肪酶活性测定方法 .利用脂肪酶在一定条件下分解三丁酸甘油酯所释放出的游离脂肪酸使指示剂 (维多利亚蓝 )变色的原理 ,根据变色圈直径的大小对酶活性进行粗略分析 ,特别适合于酶提纯过程中大批量样品酶活性的估测以及酶活性条带和其它蛋白质条带的区分 .     

用筛选抗性突变株法选育碱性脂肪酶的高产菌

以圆弧青霉白色变株ＰＢ２２７ 为出发株⒙通过多次诱变⒙筛选抗真菌抗生素的抗性株和抗底物、底物结构类似物或分解产物的抗性株⒙获得一株己酸抗性突变株ＰＧ３７⒙其产酶水平比出发株ＰＢ２２７ 菌株提高了１．５ 倍⒙达到５５７ μｍ ｏｌ／⒉ｍ ｉｎ·ｍ Ｌ⒕．ＰＧ３７ 所产脂肪酶的最适作用ｐＨ 为１０．０⒙最适作用温度为２５ ℃⒙在ｐＨ ７．０～１０．５ 范围内稳定．     

各种微生物碱性脂肪酶特性的比较

对各种不同来源的微生物碱性脂肪酶的酶学性质进行了系统研究和比较，以便能更深入全面地了解环境条件对碱性脂肪酶的影响，为碱性脂肪酸在洗涤剂中的广泛应用提供理论基础。     

圆弧青霉碱性脂肪酶发酵和纯化的研究

圆弧青霉变异株ＰＧ３７产酶最适条件：碳源用豆油;氮源用豆饼粉;装液量５０ｍｌ／５００ｍｌ三角瓶,摇瓶转速２５０ｒ／ｍｉｎ,培养温度及时间分别为２８℃和９６ｈｒ,起始ｐＨ７．５。发酵至第３６、５４和７２ｈｒ各流加０．４％豆油,发酵结束脂肪酶１５００Ｕ／ｍｌ。经过滤,硫酸铵盐析以及Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｌ－４８Ｂ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｏｌｗ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７