携带ocf 4、klf4、sox 2、,nanog 4种转录因子的腺病毒载体的构建

构建并鉴定携带人oct4、klf4、sox2、nanog 4个基因的腺病毒栽体,重组出能同时表达这4种转录因子的腺病毒.为进一步诱导多能干细胞的研究提供新方法.使用口蹄疫病毒2A序列将人的oct4、、sox2、nanog 4个基因顺序连接,定向克隆至腺病毒载体pDC328上,并在nanog下游插入红色荧光蛋白dsRed2作为报告基因.利用酶切及PCR方法鉴定病毒载体的正确性;荧光显微镜下观察病毒感染HEK 293细胞24 h后红色荧光的表达,检测病毒功能;实时定量PCR检测细胞内4种基因的表达情况.结果表明,酶切后DNA电泳鉴定证实栽体构建成功,重组后病毒PCR显示病毒携带oct4、klf4、sox2、nanog 基因;荧光显微镜下观测到红色荧光的表达,实时定量PCR检测到细胞内4种基因的表达.本研究成功构建的腺病毒载体,能够介导以上4种转录因子在细胞内的同时表达,为进一步诱导多能干细胞的提供新方法.     

携带5／35嵌合型fiber的溶瘤腺病毒对胃癌细胞的杀伤能力研究

鉴定5/35嵌合型溶瘤腺病毒对人胃癌细胞BGC-823的杀伤能力.使用荧光显微镜观察,流式细胞仪检测,病毒产量测定和MTT等一系列实验方法对5/35嵌合型溶瘤腺病毒的杀伤能力进行测定.结果表明,与5型溶瘤腺病毒相比,5/35嵌合型溶瘤腺病毒表现出更强的杀伤胃癌细胞BGC-823的能力.     

人胃癌细胞系BGC-823中SP细胞的耐药性研究

鉴定人胃癌细胞系BGC-823中的SP(side population)细胞,并进一步研究SP细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的耐受性.利用Hoechst33342对细胞染色,通过流式细胞仪检测及分选Hoechst低染的SP细胞;同样的方法检测5-氟尿嘧啶处理后的细胞中SP细胞比例的变化;MTT法检测分选后的SP与非SP细胞的抗药性差异.结果表明,人胃癌细胞系BGC-823中存在4%左右的SP细胞;细胞经过5-氟尿嘧啶处理后,SP细胞的比例显著升高;体外正常培养条件下SP细胞并不具备增殖优势,但分选后的SP细胞较非SP细胞显示出了更强的耐药存活能力.     

携带全长抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b—Anti—CD20载体构建与表达研究

构建Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒载体并探索该腺病毒在体外表达全长抗体的能力.合成部核糖体进入位点(IRES)序列,将其与美罗华抗体重轻链连接,克隆到pDC338质粒载体上,并与以11b型腺病毒(Ad11b)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒骨架质粒pAd5F11b进行重组,获得Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒.将鉴定正确的病毒空斑感染293细胞,ELISA检测其表达水平以及间接免疫荧光检测该病毒表达抗体的特异性.结果表明,嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20在293细胞中的表达量高达3.78 μg/ml±0.30 μg/ml,间接免疫荧光(IFA)显示该病毒表达的抗体只与CD20+的Raji细胞有特异性结合,而与CD20-的Molt-4细胞无结合能力.成功构建了高效表达抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20.     

昆虫杆状病毒表达egfp载体构建及鉴定

用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ将目的基因片段6His-11R-eGFP从载体pDC316-6His-11R-eGFP上酶切下来,并将该目的基因片段与供体载体pFastBacl连接构建供体质粒pFastBacl-6His-11R-eGFP;将其转化大肠杆菌(Escherichua coli)DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBac-6His-11R-eGFP,PCR鉴定得到单一目的基因条带.将该病毒载体转染Sf9细胞,进行病毒包装,在倒置荧光显微镜下观察蛋白表达,并以荧光定量PCR方法测定病毒滴度.     

无血清条件下LIF对小鼠胚胎干细胞增殖及多能性的影响

在无血清条件下培养KES小鼠胚胎干细胞,研究LIF在无血清条件下对小鼠胚胎干细胞增殖及多能性维持的影响。联合使用小分子物质SU5402、PD184352和CHIR99021或单独使用LIF培养小鼠胚胎干细胞,检测无血清条件下LIF对小鼠胚胎干细胞自我更新能力和全能性的影响。结合使用极限稀释法培养KES细胞单克隆,统计不同培养体系下单克隆的形成率。结果显示:无血清条件下,单独使用LIF,不能维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和全能性;使用含有3种小分子药物SU5402,PD184352和CHIR99021(3i)的无血清培养液可以维持小鼠胚胎干细胞的自我更新,传代60代以上仍可保持全能性;添加LIF的3i培养系统显著提高了小鼠胚胎干细胞的单克隆形成率。表明在无血清条件下,LIF不能单独维持小鼠胚胎干细胞的多能性。3i培养体系可以维持胚胎干细胞的全能性而不需要LIF;3i条件下,LIF可以显著促进胚胎干细胞体外增殖和单克隆形成。     

重组腺相关病毒2/8的聚乙烯亚胺制备法

重组腺相关病毒2/8(recombinant adeno-associated virus 2/8,rAAV2/8)是基因治疗中的一种非复制型病毒,包装困难、耗时、费力。本研究中,一种采用非病毒载体聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)来高效包装重组腺相关病毒的方法被成功建立。在成功构建并鉴定包装rAAV2/8所需的pAAV-neo-eGFP、p5E18-VD286和pSH3-D 3个质粒后,用优化过转染条件的PEI转染方法共转染这3个质粒到HEK293细胞,获得了高效稳定的转染效率,并成功包装出携带有绿色荧光蛋白eGFP的rAAV2/8。rAAV2/8的细胞感染实验表明包装出的病毒具感染活性,证明了用PEI共转染三质粒高效包装rAAV2/8具可行性。     

miR-29b对肝癌细胞中甲基化转移酶表达的调控作用

DNA甲基化异常在肿瘤发生中起着极为重要的作用,而基因组DNA的甲基化主要通过DNA甲基化转移酶(DNA methyhransferases,DNMTs)来完成。microRNA和甲基化转移酶的表达具有一定的联系。构建携带有miR-29b的腺病毒载体并包装病毒,鉴定正确后,将病毒感染肝癌细胞PLC,用qRT-PCR的方法检测miR-29b在PLC细胞中对甲基化转移酶表达的调控作用。结果表明,成功构建携带有miR-29b的腺病毒,qRT-PCR方法检测表明miR-29b能有效地调控甲基化转移酶的表达。