双芳基酮还原酶的基因挖掘及催化性质

通过基因挖掘,获得了来源于Kluyveromyces polysporus的醇脱氢酶基因kpadh,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了可溶性表达。其编码的醇脱氢酶KpADH属于短链脱氢酶家族,可催化双芳基酮不对称还原生成手性双芳基醇,且可利用异丙醇为辅底物进行底物偶联型辅因子循环。采用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白KpADH进行纯化,并研究了酶学性质。研究发现:KpADH的还原和氧化反应的最适pH分别为5.5和9.5;KpADH对1-(4'-氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲酮[1-(4'-chlorophenyl)(pyridin-2'-yl)methanone,CPMK]的K_m和V_(max)为0.500mmol/L和25.0μmol/(min·mg),对辅底物异丙醇的K_m和V_(max)分别为6.36 mmol/L和21.4μmol/(min·mg);KpADH对酮酯类底物和2,3-丁二醇有较高的催化活力。运用该重组菌对100 mmol/L的CPMK进行不对称还原,反应10 h后,底物转化率大于99.8%,产物(R)-CPMA的ee值为82%,摩尔收率88.7%。本研究为利用醇脱氢酶KpADH高效合成光学纯CPMA奠定了基础。     

产D-海因酶微生物的筛选及其催化特性

为获得高活性和立体选择性海因酶生产菌株,首先采用氨基酸关环法合成了数种5'-单取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸,建立了相关液相色谱检测方法。然后以实验室保藏的野生菌株出发,利用底物诱导的方法筛选到6株具有D-海因酶活性的野生菌,其中荧光假单胞菌产生的D-海因酶具有较好的底物谱,较高的活性和立体选择性。经优化后,其最适产酶温度为30℃,培养时间为12 h,发酵活力达到92.1 U/L。该菌催化D-海因水解的最适反应温度为60℃,pH 8.5。在50 m L体系中,利用0.25 g菌体(干重)可对映选择性水解20 mmol/L对羟基苯海因底物,反应3 h转化率达到98%。     

可得然胶生产菌种的筛选及发酵条件优化

采用苯胺蓝平板筛选法从土壤中筛选并鉴定了一株产可得然胶的根瘤菌,并对该菌株发酵合成可得然胶的培养基进行优化。在单因素优化的基础上,设计4因素3水平的正交优化方案,优化结果显示,该菌株发酵产可得然胶的最优培养基组成为:葡萄糖50 g/L,(NH4)2HPO42g/L,KH2PO41.5 g/L,Mg SO41.25 g/L,Fe SO4·7H2O 0.05 g/L,Mn SO40.02 g/L,Co Cl2·6H2O 0.01 g/L,Zn Cl20.01 g/L。经摇瓶发酵验证,可得然胶的产量和糖转化率较优化前分别提高了29.2%和5.4%,为进一步利用该根瘤菌发酵合成可得然胶奠定了良好基础。     

利用Clostridium saccharobutylicum DSM 13864 连续发酵生产丁醇

为使用廉价糖质原料进行连续发酵生产丁醇提供理论依据和实验指导,以Clostridium saccharobutylicum DSM 13864为发酵菌种,考察了稀释率和温度等因素对以葡萄糖为原料的四级连续发酵生产丁醇的影响。结果表明：高稀释率有利于酸的积累和菌体的生长,低稀释率有利于溶剂的生产。当稀释率为0.05 h?1,4个发酵罐温度控制在37 ℃时,总溶剂产量为11.57 g/L,其中丁醇7.29 g/L,生产率为0.145 g/(L?h)。在0.05 h?1稀释率的条件下进行变温连续发酵证实低温有利于溶剂的积累,当一级和二级罐温度控制在37 ℃,三级和四级罐温度控制在33 ℃时总溶剂产量最高为13.69 g/L,其中丁醇为8.36 g/L,生产率为0.171 g/(L?h)。     

低共熔溶剂和次氯酸钠组合预处理秸秆及在丁醇发酵中的应用

随着传统化石能源日趋枯竭,木质纤维素生物质等可再生资源的综合利用得到越来越多的关注。为了更好地利用木质纤维素生物质,采用物理、化学或生物方法降低其结构顽抗性是必不可少的步骤。在前期研究中,本文作者所在实验室发现了一种乙胺盐酸盐为氢键受体、乳酸为氢键供体的新型低共熔溶剂（EaCl∶LAC）,其对玉米芯有很好的去除半纤维素的作用。本文将EaCl∶LAC用于预处理水稻秸秆,并结合碱性氧化剂NaClO,进一步提高了木质素的去除率。在最优条件下,经EaCl∶LAC/NaClO预处理后水稻秸秆的半纤维素和木质素的去除率分别为94.9％和80.2％。将预处理后水稻稻秆经纤维素酶解可得到总还原糖浓度为60.46g/L的秸秆水解液。采用梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM13864利用稻秆水解液进行丁醇发酵,72h后丁醇浓度为10.16g/L,丁醇的糖醇产率为0.22g/g_{total sugar}。本文提供了一种提高木质纤维素生物质酶解效率和水解液还原糖浓度的方法,无需外源添加葡萄糖和脱毒处理,可直接用于发酵合成生物丁醇。     

秸秆碱预处理液脱毒及其在丁醇发酵中的应用

秸秆的碱预处理液可造成严重的环境污染。该研究基于源头控制的理念,对碱预处理液进行脱毒工艺研究并回收进行丁醇发酵研究。通过加酸去除碱预处理液中的木质素,用活性炭将去除木质素的预处理液脱毒并用于水解和发酵过程。优化获得沉淀碱溶性木质素的最佳pH 3. 8;不同加量活性炭脱毒后的碱预处理液对秸秆水解的影响不明显,然而活性炭的添加量对丁醇发酵影响较大,当活性炭添加量为15 g/L时,发酵72 h达到最高丁醇质量浓度10. 2 g/L。该秸秆碱预处理液脱毒工艺对利用秸秆进行无废生产生物燃料有一定参考价值。     

填充床反应器中固定化假单胞菌细胞连续制备L-瓜氨酸

对实验室筛选的产精氨酸脱亚胺酶的假单胞菌( Pseudomonas sp.)进行了固定化,以及对固定化细胞转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸进行了研究.比较4种不同固定化方法,确定卡拉胶包埋结合戊二醛后处理为假单胞菌的细胞固定化方法.固定化反应的最适pH值为6.5,细胞固定化后细胞精氨酸脱亚胺酶的热稳定性增加.在50 mm×240 mm固定填充床反应器中,底物浓度为0.5 mol/L L-精氨酸盐酸盐,pH值6.5,温度37 ℃,稀释速率为0.147/h的条件下,连续运转54 d,固定化细胞对底物的摩尔转化率在95%以上,平均生产强度 0.010 8 g/(h*g)(每单位质量的固定化细胞每小时生产的瓜氨酸质量).转化液经732阳离子树脂吸附,氨水洗脱,及浓缩、结晶,得到纯度为99%的L-瓜氨酸晶体,提取总收率约为87%.     

新工科背景下生物催化工艺学教改的探索和实践

在新工科建设和双一流建设的双重背景下,高等学校在培养学生的创新能力和科学素养方面面临新挑战.《生物催化工艺学》重点培养学生应用生物技术解决传统化学合成行业的瓶颈问题的创新能力.然而,传统教学模式不能满足新工科背景下人才培养的需求.在互联网+时代,可以通过翻转课堂结合微信平台作为教学辅助工具,以学生为教学主体,采用互...     

醇脱氢酶KpADH的127位点对催化活性和对映选择性的影响

醇脱氢酶可用于合成手性化合物,在医药、材料等领域应用广泛。来源于多孢克鲁维酵母（Kluyveromyces polysporus）的醇脱氢酶KpADH同时具有还原(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮（CPMK）和氧化异丙醇、1,4-丁二醇的活性。通过分子对接和结构分析,发现Y127是紧靠底物的关键位点。本文通过对127位点定点饱和突变来提高催化活性和对映选择性,突变体Y127V和Y127I还原CPMK的比活力达到95.0U/mg和84.0U/mg,分别是野生型的6.5倍和5.8倍,突变体Y127L催化CPMK生成(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[(R)-CPMA]的e.e.值由82％提高到99.2％。同时,127位点的突变提高了对醇类底物的氧化活性,突变体Y127I对异丙醇的比活力是野生型的1.46倍,而Y127C更青睐于对1,4-丁二醇的催化氧化,其比活力是野生型的3.00倍。分子间作用力分析表明,Y127L与底物CPMK间增加的氢键和π-π作用力稳定了底物构象,进一步提高了还原CPMK的对映选择性。本文为醇脱氢酶KpADH的分子改造和机制解析提供了指导,提高了该酶的工业应用潜力。     

Lipozyme TL 100L的固定化及其催化合成蔗糖-6-乙酯

采用树脂吸附法固定脂肪酶Lipozyme TL 100 L,并用于催化合成蔗糖-6-乙酯（S-6-a）。比较7种树脂对Lipozyme TL 100 L的吸附与固定化酶合成S-6-a能力,选择非极性大孔树脂HZ-802为固定化载体。固定化酶在吸附温度30 ℃,蛋白吸附量50.47～58.1 mg/g树脂,相对水含量小于5%时,S-6-a产率达80%以上。用异丙醇以体积比0.5∶1处理Lipozyme TL 100 L,固定化酶的S-6-a产率可达95.4%。固定化酶反复使用8次,S-6-a产率仍有34.2%。与商品固定化酶Lipozyme TLIM相比,HZ-802吸附法制备的固定化酶催化转酯反应的活化能降低了6.47 kJ/mol。