rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证

构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K. lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac Ⅱ线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K. lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR (RTQPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33) U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K. lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K. lactis的进一步分子改造提供参考。     

甘油代谢对酿酒酵母酒精发酵的影响

以工业酒精酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae Y)为对象,通过生孢子法获得其a型和α型单倍体.根据同源重组原理构建整合载体pUC19-GPD1::Q Km 线性化后电击转化进入a型单倍体.G418抗性筛选缺失GPD1基因的转化子S.cerevisiae Y(a,△gpd1).重组菌S.cerevisiae Y(a.△gpd1)与α型单倍体杂交获得二倍体,采用PCR扩增法鉴定得到GPD1全突变菌株S.cerevisiae Y(△gpd1,△gpd1).分别以20 g/L和150 g/L的初糖在摇瓶中进行发酵实验考察.结果表明,S.cerevisiae Y(a,△gpd1)的葡萄糖转甘油率分别从12.43%和6.04%降低到9.35%和5.54%,葡萄糖转酒精率分别从36.4.9%和39.96%提高到36.91%和40.29%;而S.cerevisiae Y(△god1,△gpd1)的葡萄糖转甘油率分别从14.16%和7.49%降低到10.46%和5.79%,葡萄糖转酒精率分别从36.23%和39.89%提高到38.52%和41.50%.     

离子交换树脂固定化α-淀粉酶的研究

选择12种吸附和离子交换树脂对α-淀粉酶进行固定化,筛选出固定效果较好的D380大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为载体,通过先吸附后交联的方法固定化.通过实验对加酶量、交联剂浓度、吸附时间、吸附pH等能够影响固定化酶活力回收率的因素的研究和优化,得出较优的固定化条件为:戊二醛浓度0.1%、处理时间45min、加酶量3mg/g(蛋白量/载体)、酶液pH5.8、25℃、固定化处理时间为6～10h,获得的固定化酶活力可达80U/g(载体),并进一步对固定化后的酶学性质作了初步研究.     

枯草芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件的优化

为进一步提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液态发酵产凝乳酶(milking-clotting enzyme,MCE)的能力,采用单因素试验和响应曲面法对枯草芽孢杆菌液态发酵的产酶条件进行研究和优化。结果表明：最优发酵工艺为：葡萄糖添加量16.2g/L,在500mL 三角瓶中装53.3mL 料液,接种量为体积分数0.130%,发酵时间120.43h,预测酶活力为1097.30SU/mL,经实验验证,在该条件下发酵产凝乳酶的酶活力为(1129.05 ± 74.55)SU/mL,与模型预测值相符。     

1株古细菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

来源于古细菌嗜酸硫化叶菌（ S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s ） 的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosylterhalose synthase,MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase）联合作用,可以利用淀粉为底物生成海藻糖。本研究构建了6 种枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体,将密码子优化后的MTSase和MTHase编码基因在木糖异构酶基因的启动子及其阻遏蛋白介导下实现了在枯草芽孢杆菌中的功能表达,木糖启动子分别来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。在以5 g/L甘油为碳源,24 g/L蛋白胨为氮源时,菌体培养8 h后加入终质量浓度为6 g/L的木糖,37 ℃诱导16 h后重组MTSase、MTHase产生联合作用,海藻糖转化率达到33.57%。实现了MTSase、MTHase在枯草芽孢杆菌中的功能表达。     

混流式转轮内部流场的涡动力学分析

本文通过理论分析,推导了水轮机叶片所受力矩的涡动力学表达式,阐述了用涡动力学分析从全局和局部诊断水轮机内部流动的原理。用数值方法对混流式水轮机的转轮内部流场进行了计算,采用了全三维全流道的湍流计算方法,基于标准k-ε湍流模型和SIMPLEC数值方法,从导叶进口到尾水管出口,包含所有流道在内的整体一次完成计算。根据得到的流场数据,对转轮内部流场进行了涡动力学分析,得到了叶片表面的BVF分布和表面摩擦力线的分布,进行了全局和局部流场诊断,通过和用压力、速度等传统分析方法的对比,结合试验数据,验证了涡动力学分析方法的实用性。     

考虑源荷不确定性与碳减排的复合储能系统优化配置模型

在大规模光伏接入的清洁低碳型配电网建设背景下,为实现分布式光伏、负荷、储能设备与电网之间的协调运行,提升配电网的碳减排能力,针对光伏出力与负荷需求不确定性问题,提出了一种考虑源荷不确定性与碳减排的复合储能系统优化配置模型。通过对配电网内光伏和负荷特性进行分析,建立光伏出力与负荷需求不确定性模型;以复合储能系统综合成本最小、碳排放量最小、光伏功率波动平抑效果最好、能源利用效率最大为目标,基于概率的机会约束IGDT构建配电网复合储能系统优化配置模型,并进行求解;通过进行算例仿真验证所提复合储能系统优化配置模型的有效性。     

重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成钙二醇的初步研究

钙二醇(25-hydroxy vitamin D₃,25-OH V_D3)是一种具有广泛生理活性及药用价值的物质。该文旨在通过分子生物学手段构建1株异源表达V_D3羟化酶(V_D3 hydroxylase, Vdh)的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-vdh,使其可以利用细胞催化系统合成25-OH V_D3。该重组菌株经诱导表达后,首先利用CO差光谱法评价Vdh的体外活性,并将其用作全细胞催化剂合成25-OH V_D3,随后通过优化温度、时间、转速及pH等全细胞转化条件,提高其转化合成25-OH V_D3的产量。结果表明,37℃下培养24 h后,重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pMA5-vdh的菌体裂解物酶活力达0.56 nmol/g;并且在底物质量浓度为0....     

黏土层的挤压破坏在自升式钻井平台插桩分析中的应用

自升式钻井平台桩腿穿刺分析是插桩分析的关键。对于上硬下软土层,常规的穿刺破坏模式分析方法即3:1分析方法在工作实践中应用较多。但对于大直径桩靴,利用常规穿刺破坏模式进行分析会遇到插桩预测深度不准确的问题。分析了常规穿刺破坏模式和黏土层的挤压破坏模式的发生机理,探讨了二者计算方法的不同之处及发生条件,并结合实际案例,验证了挤压破坏模式在"两强夹一弱"的土体结构中能够较准确地预测大直径桩靴的入泥深度,可为钻井平台穿刺分析提供一定的借鉴经验。     

无加劲方钢管柱-H形钢梁节点弹性刚度的级数解答

按照欧洲规范EU3(EN1993-1-8)的计算方法,平面无加劲方钢管柱与H 形钢梁直接焊接节点一般情况下是半刚性的,其半刚性主要是由于柱壁平面外变形引起的.为准确计算包含这种节点的结构的位移、构件内力,需要确定节点弹性刚度.日本规范《钢构造接合部设计指针》根据试验和数值分析结果拟合出了该刚度的计算公式,但在力学概念上存在缺陷,且当梁与柱材料屈服强度取不同值时的计算结果与实际情况差异较大.该文从经典弹性板壳理论出发,依据数值分析建立的梁翼缘截面应力分布模型,推导出与柱壁变形相关的刚度的级数解答,其结果与试验数据、有限元数值结果能较好吻合.