人破骨细胞形成抑制因子活性域片段在大肠杆菌中的融合表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesisinhibitoryfactor,OCIF)活性域片段。方法　从中国人正常肝细胞系LO2中提取总RNA ,利用RT PCR得到OCIF活性域编码基因cDNA ,将其与pMD18 T连接 ,转化大肠杆菌K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18 OCIFAD ,经双酶切得到OCIF活性域编码片段 ,将其插入pMAL c2载体中 ,转化大肠杆菌TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果　所获得的OCIF活性结构域编码序列片段经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS PAGE分析可见在相对分子质量 6 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Westernblot证实了表达产物能与抗人OCIF单抗发生特异性反应。结论　已成功地获得了人OCIF活性结构域编码片段的克隆 ,并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。表达产物对体外培养破骨细胞的骨吸收功能有明显的抑制作用。     

CuZn-SOD乳酸-羟乙酸共聚物缓释微球的制备及体外、体内释放研究

目的 探讨CuZn-SOD包裹入乙酸-羟乙酸共聚物制备的药物微球的缓释效果。方法 采用复乳法制备CuZn-SOD乙酸-羟乙酸共聚物(PLGA)药物微球,分别用恒温摇瓶法和ELISA法检测体外和体内的释放效果。结果 有机相/分散相体积比、内水相体积、蛋白质浓度等因素影响微球的性质,由于聚合物的吸附作用,CuZn-SOD的体外释放呈明显的两段释放,释放不完全;体内释放显示微球制剂有一定的缓释效果。结论 该微球有比较好的缓释作用。     

肝素黄杆菌肝素酶性质的研究

目的研究肝素酶I的理化性质。方法测定肝素酶I的相对分子质量、等电点、紫外吸收光谱、N端序列,以及各种环境因素对酶活性和酶稳定性的影响。结果相对分子质量约为43×103,等电点为8.5。N端序列不能测到。酶的最适催化条件为:温度45℃,pH6.4～7.0,离子强度150mmol/L。酶在35℃以上极易失活,在pH7～11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280nm。H2O2(1mmol/L,10mmol/L),NaN3(10mmol/L,100mmol/L),乙腈(1%,10%),1mol/L盐酸胍和1mol/L尿素对酶的活性无影响;1%SDS,4mol/L盐酸胍和4mol/L尿素则使酶完全失活;CaCl2和MgCl2是该酶的激活剂,FeCl2则对该酶的活性具有抑制作用。结论通过实验,测定了肝素酶I的主要理化性质。     

TAT-凋亡蛋白质制备与抗肿瘤活性研究

目的 制备TAT-凋亡蛋白质并研究其抗肿瘤活性.方法 将重组质粒pET-28b-TAT-vp3转/N.E.coli BL21(DE3)中表达其蛋白质,利用Ni-NTA亲和柱纯化目的 蛋白质包涵体,纯化样品透析复性后研究其抗肿瘤活性.结果 30℃时重组蛋白质包涵体表达量最高,尿素变性条件下用Ni-NTA亲和柱层析纯化包涵体,用500 mmol/L咪唑溶液洗脱,从镍柱上解离的目标蛋白质纯度达到92%以上.MTT实验表明,纯化后蛋白质浓度10μg/mL时,HeLa细胞存活率降至42%(ICso=4.2μg/mL);动物实验表明,样品组抑瘤率可达到48.3%.结论 大肠杆菌表达的TAT-凋亡蛋白质具有抗肿瘤效应.     

凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的 构建来自鸡贫血病毒(CAV,chicken anaemia virus) VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性.方法 PCR(polymerase chain reaction)获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E.coli BL21(DE3)中表达.用Ni-NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性.结果 目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90%,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性.结论 成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础.     

凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的构建来自鸡贫血病毒（CAV,chicken anaemia virus）VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性。方法PCR（polymerase chain reaction）获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E．coli BL21（DE3）中表达。用Ni—NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性。结果目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90％,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性。结论成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础。     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

重组羧肽酶原B甲醇酵母的构建与分泌表达

目的构建重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株。方法将羧肽酶原B编码基因整合人酵母质粒,电转化至甲醇酵母中,His缺陷培养基和G418抗性筛选获得阳性克隆株。用大肠杆菌表达的羧肽酶原B免疫家兔制备羧肽酶原B兔抗血清;经发酵、甲醇诱导后,蛋白质印迹（Western-blotting）免疫检测蛋白质的表达。结果获得高抗体滴度的羧肽酶原B兔抗血清,蛋白质印迹免疫检测重组酵母经甲醇诱导表达后的上清阳性。结论获得了重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株,可分泌表达重组羧肽酶原B。     

重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达的优化

目的获取活性高的重组SOD1／3杂合酶。方法用含pET—SOD1／3的工程菌诱导表达重组SOD1,3杂合酶,通过分析SDS—PAGE及SOD酶活性,考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、Cu^2＋、Zn^2＋浓度对重组酶表达量和活性的影响。结果正交试验表明,用lmmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在A600=1．2时诱导,Cu^2＋、Zn^2＋浓度分别为2．4mmol／L,诱导温度15℃,诱导时间12h,能获得高活性重组SOD1／3,其比活性为1681U／mg。结论培养温度和Cu^2＋、Zn^2＋浓度是优化表达的最主要因素。降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达,添加CU^2＋、Zn^2＋能促进重组酶活性提高。     

重组羧肽酶原B甲醇酵母的构建与分泌表达

目的构建重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株。方法将羧肽酶原B编码基因整合入酵母质粒,电转化至甲醇酵母中,His缺陷培养基和G418抗性筛选获得阳性克隆株。用大肠杆菌表达的羧肽酶原B免疫家兔制备羧肽酶原B兔抗血清;经发酵、甲醇诱导后,蛋白质印迹(Western-blotting)免疫检测蛋白质的表达。结果获得高抗体滴度的羧肽酶原B兔抗血清,蛋白质印迹免疫检测重组酵母经甲醇诱导表达后的上清阳性。结论获得了重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株,可分泌表达重组羧肽酶原B。