胸腺素α1的基因合成、表达及活性测定

目的　合成胸腺素α1(Tα1)基因并在原核细胞中表达。方法　用半酶半化学合成并克隆Tα1基因 ,将该基因插入表达质粒pGEX 4T 1并在大肠杆菌进行表达 ,对表达的融合蛋白GST Tα1利用亲和层析法纯化 ,再经Thrombin酶切后 ,获得重组Tα1进行生物学活性检测。结果　经测序证实合成的Tα1序列与设计的一致。构建的重组表达载体pGEX 4T 1 Tα1在大肠杆菌中得到高效表达。E玫瑰花结形成试验证明重组Tα1具有生物学活性。结论　合成的Tα1基因在大肠杆菌中表达出具有生物活性的蛋白。     

重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解

目的　研究重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解。方法　通过质谱和氨基酸序列分析确定水蛭素的 4种活性异构体 ,再用HPLC监测发酵过程中水蛭素的降解情况。结果　发酵过程中产生了 4种具有较高比活的水蛭素异构体 ,它们分别是目的产物水蛭素Hir6 5及Hir6 5的C 末端降解 1～ 3个氨基酸的产物。发酵时细胞干重达到 16 2g/L ,水蛭素的总活性一直在增加 ,最高为 2 .4 5× 10 4ATU/ml,相当于总产量1.8g/L。但Hir6 5在 4种水蛭素异构体总量中的比例一直在下降。Hir6 5的产量先升高再降低 ,最高为 2 80mg/L。结论　毕赤酵母发酵过程中水蛭素存在降解 ,Hir6 5降解产生了Hir6 2和Hir6 3。     

甲肝和麻疹病毒混合感染人胚肺二倍体细胞病毒增殖动态及与细胞相互作用的研究

目的　探讨甲肝病毒 (HAV)和麻疹病毒 (MV)混合感染人胚肺二倍体细胞 2BS株 (2BS)病毒增殖动态及病毒与细胞相互作用的关系 ,为制备甲肝 -麻疹二联活疫苗提供基础资料。方法　将HAV和MV先后感染2BS ,应用细胞病理学、亲和素 生物素系统免疫组化技术和电镜技术检测HAV和MV在 2BS内增殖动态及 2种病毒与细胞的相互关系 ,观察HAV和MV在细胞内的超微结构。结果　HAV和MV能在同一种细胞基质中增殖 ,也能在同一个细胞中增殖 ,但 2种病毒与细胞的相互作用明显不同。结论　HAV对MV的再感染似乎无明显干扰现象     

中国人丙型肝炎病毒全长NS3基因的克隆、序列分析及表达

目的　为改进HCV试剂的质量克隆 1b型丙型肝炎病毒 (HCV)全长NS3基因并在原核细胞中表达。方法　用RT PCR方法从中国人血清中扩增全长NS3片段 ,进行序列分析 ,并克隆到pET3 0a(+)原核表达载体中 ,构建的原核表达载体pET NS3 180 0在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达 ,用Westernblot方法进行验证。结果　扩增到 1b型HCV全长NS3片段 ,经Westernblot实验表明该片段具有抗原活性。结论　构建的质粒可在大肠杆菌中表达完整的NS3蛋白     

中国部分地区甲型肝炎病毒基因型分析

目的　分析中国部分地区甲型肝炎病毒 (HepatitisAvirus,HAV)的基因型。方法　采自辽宁 (LN1、LN2、LN3 )、上海 (Lu3 8)和云南 (YN)甲型肝炎病人的粪便标本共 5份 ,从中分离纯化HAV并提取病毒RNA ,以逆转录 半嵌套聚合酶链式反应 (RT hnPCR)合成VP1 2A交接区及VP1氨基端 ,经克隆筛选后进行测序分析。结果　所分离到的 5株HAV野毒株VP1 2A交接区 168个核苷酸 (nt)的片段与IB亚型的野毒株HM175比较 ,核苷酸差异 >7.5 % ;与IA亚型的日本野毒株AH1、AH2、AH3、FH1、FH2和FH3比较差异 <7.5 % ,因而均属IA基因亚型。但与IB亚型的野毒株MBB比较 ,LN1、LN3和Lu3 8在该区域的核苷酸差异 <7.5 %。进一步将LN1的VP1 2A交接区 3 3 9nt的片段、LN3和Lu3 8的VP1氨基端的核苷酸序列与MBB进行比较 ,核苷酸差异 >7.5 % ,表明这 3株HAV仍属IA基因亚型。结论　所分离到的HAV野毒株LN1、LN2、LN3、Lu3 8和YN均属IA基因亚型     

人BLys 78-285的高效表达、纯化及功能鉴定

目的 克隆人B淋巴细胞刺激因子(B-lymphocyte stimulator,BLyS)胞外区cDNA,并行高效表达、纯化及功能鉴定。方法 提取 HL-60细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人 BLyS胞外区 78-285氨基酸 cDNA,行序列测定后,构建高效原核表达载体pQE-80L,经 IPTG诱导表达及 Ni-NTA层析纯化,SDS-PAGE和 Wester blot检测活性。结果 RT-PCR扩增得到627bp的DNA片段,序列分析与CenBank中报道的编码BLyS 78-285的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中得到高效表达,纯化后纯度可达95％,并能刺激B淋巴细胞增殖。结论 成功克隆人 BLyS胞外区cD-NA,并获得了高效表达,纯化产物具有生物学活性,为进一步研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因克隆及表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)过氧化氢酶(katA)基因并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,将其克隆入pET-11c载体中,经测序证实后,在大肠杆菌中进行表达,产物用Western blot检测其抗原性并进行N末端氨基酸的测序。结果 幽门螺杆菌katA基因全长1 518bp,编码氨基酸505个。在BL21(DE3)中的表达量约占细菌总蛋白的24.9％,表达产物经SDS-PAGE显示其相对分子质量与软件预测结果 58 000相符,N末端5个氨基酸测序结果与Hp中天然的katA完全一致,经Western blot检测可被 Hp全菌抗血清识别。结论 katA能在大肠杆菌中进行高效表达,具有良好的免疫反应性,可望为研究 Hp的致病机理、实验诊断及亚单位疫苗等提供充足的katA原材料。     

蛇毒类凝血酶基因真核表达载体的构建

目的 构建大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin,GSB)基因真核表达载体,试图借助IL-2的分泌通路,使GSB分泌至胞外而达到溶栓和防栓的目的。方法 应用PCR重组技术,将GSB的5’端和3’端分别与IL-2基因的信号肽和poly A尾相连接,将此重组基因克隆入逆转录病毒载体 pLNCX,以脂质体介导转染人外用血淋巴细胞,并以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因检测转染效率、确定DNA和脂质体的比例。转染24h后从mR-NA、DNA和蛋白质水平检测GSB的表达情况。结果 mRNA和DNA水平均有外源基因GSB的表达;SDS-PAGE显示在相对分子质量 30 000左右出现一条带,且转染上清具有精氨酸酯酶活性。结论 构建的真核表达载体可表达具有活性的GSB,为GSB基因治疗血栓的体内研究打下基础。     

应用质谱扫描测定胸腺肽相对分子质量

目的 精确测定胸腺肽相对分子质量分布。方法 采用质谱扫描法。结果 3批胸腺肽相对分子质量均在2000～4000,无10 000以上的大分子蛋白。结论 本方法灵敏度高,可直观地测定胸腺肽相对分子质量分布状况,为控制胸腺肽质量提供了新的检测方法。     

精制胸腺活性肽药效学研究

目的 考察精制胸腺活性肽免疫学活性。方法 建立BALB/c小鼠肝细胞肿瘤(腹水型)模型,经腹腔连续注射肝肿瘤细胞15d,检测各种生命指标,以观察抗肿瘤效果。同时用E-玫瑰花环实验及淋巴细胞转化实验评价其生物学活性。结果 抗肿瘤实验表明,生命各项指标均优于盐水对照组,用药组10d、15d的存活率明显高于对照组;E-玫瑰花环及淋巴细胞转化实验均显示精制胸腺活性肽组明显高于对照组。结论 精制胸腺活性肽具有明显的免疫增强作用。