低温乳化香肠加工过程中单核细胞增生李斯特氏菌的限量标准建议

为完善低温乳化香肠中单核细胞增生李斯特氏菌的风险管理研究,采用检出率-剂量曲线法,同时基于本课题组之前已完成的低温乳化香肠中单核细胞增生李斯特氏菌定量风险评估研究结果,分别制定整合和未整合交叉污染过程低温乳化香肠的食品安全目标（food safety objective,FSO）。基于低温乳化香肠的FSO值,进一步推算,制定相应的执行目标、执行标准以及微生物标准（microbiological criteria,MC）等,同时采用操作特征曲线对已制定的采样方案和MC性能进行评估。结果表明：整合和未整合交叉污染过程低温乳化香肠的FSO值分别为0.36（lg（CFU/g））、－4.58（lg（CFU/g））。整合交叉污染的标准制定结果更为严格,且过程中耗费的人力物力更少。未整合交叉污染的过程高估了消费者风险,同时低估了生产者风险。     

侧流层析技术研究进展

在毛细管层析作用下,基于抗原抗体特异性结合或核酸探针和靶向核酸杂交反应来检测样品中的目标物质 的侧流层析技术与传统检测方法相比,以其成本低、特异性强、稳定性高、节省时间、不需专业人员、可现场检 验、结果肉眼可见等优势,广泛运用在人体临床医学、动植物医学、食品安全、环境监测等领域。本文重点介绍了 侧流层析技术的背景、原理、设计以及国内外应用现状、发展前景等,以期为侧流层析技术的发展提供参考。     

单增李斯特菌prfA基因缺失菌株的构建及其生物学特性鉴定

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种风险较高的食源性致病菌,其绝大多数毒力基因的表达均受到由prfA基因编码的PrfA(positive regulatory factorA)蛋白全部或部分调控。使用同源重组的方法敲除Lm野生菌株EGDe的prfA基因,并通过测定生长曲线、毒力基因表达和侵袭Caco-2细胞能力等探讨单缺失菌株EGDe-ΔprfA生物学特性。通过测定生长曲线显示prfA敲除株和野生型EGDe二者生长状态无差异;运用实时定量荧光聚合酶链式反应检测EGDe-ΔprfA的主要毒力基因表达,结果显示plcA、plcB毒力基因的表达量分别上升至原来的2.5倍和2倍,inlA、inlB、inlC、actA、vip等均呈下降趋势,prfA基因表达量趋向于零;侵袭Caco-2细胞结果显示EGDe-ΔprfA侵袭数为野生株的1/5。该基因缺失菌株的构建及生物学特性研究对食源性致病菌EGDe致病机理研究具有重要意义并且提供了重要材料。     

不同培养基及培养条件对单增李斯特菌ERIC-PCR分子分型的影响

本研究以实验室保存的26株李斯特氏菌为实验对象,通过ERIC-PCR和凝胶电泳技术对其展开基因分型,并根据分型结果选取不同亚型菌株,进而考虑改变细菌培养条件来探究不同培养基对李斯特菌ERIC-PCR分子分型结果的影响。实验结果初步表明,实验室26株李斯特菌至少可分成11个主要基因类群,其中Ⅰ型菌株最多占有8株,而Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ以及Ⅺ型均最少,各占1株;同时发现,培养基及培养条件的改变会对LM87、LM109(野生型单增李斯特菌)分型结果产生影响,且这些菌株分型均最少。由此推断,不同的营养机制和培养条件可能会对李斯特菌的基因组稳定性或基因表达带来潜在影响,因此无论是在对LM致病机理的基础研究过程中还是对其进行分子分型鉴定,都必须考虑其寄主来源以及培养条件。     

单增李斯特菌(EGDe)sigB基因缺失株的构建及其生物特性的初步鉴定

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患的食源性致病菌,在感染过程中可以穿越人体肠道屏障、胎盘屏障及血脑屏障,进而引发肠胃炎、脑膜炎及孕妇流产等疾病。Sigma B(sigB)基因编码产生的sigma B因子是许多革兰氏阳性菌对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子,并且直接或间接的调控Lm中相关重要毒力基因如prf A、inl A等的表达。本文通过同源重组技术将Lm野生菌株EGDe的sigB基因敲除,并且对缺失菌株的生长曲线,inl A、inl B、prf A等13种Lm的毒力基因表达水平及对肠道上皮细胞Caco-2的侵袭进行了研究。实验表明,EGDe-ΔsigB基因缺失菌株生长速度与EGDe基本一致;sigB基因的缺失造成inl A和inl B基因表达水平的大幅度下调,但act A和plc A等毒力基因却上调4~5倍,说明sigB基因对于单核增生性李斯特菌的一些毒力基因表达影响比较大;Caco-2细胞的侵袭实验显示EGDe-ΔsigB基因的缺失对Caco-2细胞侵袭能力的下降。     

大肠杆菌O157:H7的免疫捕获PCR快速检测

研究用特异性的出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被处理的PCR管,对样品中的病原菌进行特异性免疫富集,以免疫捕获-PCR(Immunocaptured PCR,IC-PCR)管中捕获到的病原菌作为模板进行PCR扩增。结果显示免疫捕获-PCR对病原菌出血性大肠杆菌O157:H7检测灵敏度达到102CFU/mL,比直接PCR和ELISA提高了103倍;特异性验证实验证实,对其他10株食源性致病菌进行检测均无目标条带。该方法将免疫学和分子生物学检测结合起来,灵敏度高,特异性强,检测周期短,检测迅速,是适合检测一线进行快速检测的新方法。     

两种酶标抗体制备方法的比较及李斯特菌TASELISA试剂盒性能的优化

研制一种低成本、快速、准确的三抗体夹心酶联免疫(Three antibodies sandwich ELISA,TAS-ELISA)检测试剂盒。采用戊二醛法、改良过碘酸钠法分别制备碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP)、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG,比较单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)TAS-ELISA试剂盒两种酶标抗体的检测效果,并考察了试剂盒的检测灵敏度、特异性、稳定性、保存周期等指标。结果表明,采用改良过碘酸钠法制备的HRP-IgG效果好,克分子比最高可达2.9,酶结合率达27%;试剂盒检测周期6h,检测成本为3.5元/孔,特异性实验、干扰实验、重复性实验、稳定性实验表明采用该方法制备的酶标抗体,特异性好、结果稳定可靠。自制TAS-ELISA试剂盒检测性能可达到商业化试剂盒水平,为该产品的产业化提供了一定的理论依据。     

免疫捕捉PCR和直接PCR技术检测单核细胞增生性李斯特菌比较研究

将免疫学技术与分子生物学技术相结合,建立了免疫捕捉PCR(IC-PCR),并与传统的直接PCR(Direct-PCR)进行比较。结果显示:纯菌液中IC-PCR检测灵敏度(104CFU/mL)是Direct-PCR灵敏度(105CFU/mL)的10倍;模拟带菌实验结果表明:IC-PCR最低可检测到5×101个细菌/PCR反应体系(即104CFU/mL),检测限比Direct-PCR(5×103个细菌/PCR反应体系即106CFU/mL)高100倍;特异性实验、干扰实验结果表明IC-PCR可特异检测单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monaytogenes,LM),而和18株其他常见食源性致病菌无交叉反应。IC-PCR具有快速、经济、灵敏、特异等优点,是一种适合食品安全监管部门、食品企业的LM快速检测方法。     

食源性致病菌生长延滞期建模的研究进展

基于预测微生物学理论,准确预测食源性致病菌的数量及生长对降低食品安全风险具有重大意义。本文针对近年来国内外食源性致病菌生长延滞期的建模工作,从食源性致病菌延滞期的测定方法和建模方法两方面进行综述。通过分析现有延滞期建模的相关研究,指出目前延滞期建模研究中存在的问题。建议未来应基于微生物生长机理明确延滞期定义,进一步根据延滞期定义改进、创新延滞期测定方法及建模方法,同时量化分析延滞期影响因素并整合延滞期建模。     

基于可视化抗体宏阵列技术的出血性大肠杆菌O157∶H7定量检测

目的：探索建立一种新的出血性大肠杆菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）的快速定量检测技术。方法：以硝酸纤维素膜为基片,用生物芯片点样仪制作抗体宏阵列,采用“双抗夹心”原理,对出血性大肠杆菌O157∶H7进行定量检测研究。结果：本方法对出血性大肠杆菌O157∶H7的检出限为3.4×105 CFU/mL,在105～107CFU/mL细菌浓度范围内,宏阵列的灰度值与细菌浓度之间有较好的线性关系。该方法可在2.5 h内同步检测多个样品中出血性大肠杆菌O157∶H7的浓度。结论：通过用标准菌株、模拟带菌等研究显示,用宏阵列技术快速定量检测出血性大肠杆菌O157∶H7,结果肉眼可见,稳定准确,同时操作简便、成本低廉、无需大型设备,制作好的抗体宏阵列可用于快速评估食品中出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,尤其适合于基层实验室进行快速高通量样品筛查。