单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time RPA)方法。基于LMhly A基因保守序列,设计合成特异性RPA引物和exo探针,所建立的LM real-time RPA方法能够在37℃等温条件下20 min内完成扩增。该方法仅对LM基因组DNA为阳性扩增,对其它20种致病菌基因组DNA的扩增均为阴性;以LM纯培养菌液的基因组DNA进行10倍列梯度稀释,并以之作为模板,其灵敏性可达到5×10-1 pg,与实验室已建立的real-time PCR方法一致。人工污染实验中,对于LM接菌量为3 CFU/25 g的羊肉和生菜样品,增菌14 h即可通过建立的real-time RPA方法检出,与传统培养方法和real-time PCR检测结果均一致,但是前者所需时间明显少于后者。本文建立的LM real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,反应迅速,并能够摆脱对价格昂贵的荧光PCR仪和专业实验室的需求,可应用于食品突发事件中LM的现场快速检测,对保障我国食品安全具有重要意义。     

金黄色葡萄球菌基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱的鉴定与聚类分型

目的 建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption lonization-time of flight mass spectrometer, MALDI-TOF MS)快速鉴定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)并自建数据库, 进行聚类分型。方法 基于MALDI-TOF MS技术, 对经全自动微生物分析仪(VITEK2 COMPACT)鉴定为S. aureus的25株分离株和1株标准菌株(ATCC 25923)进行鉴定。并进一步采集26株S. aureus特征性蛋白质指纹图谱, 使用flex Analysis软件进行分析, 汇总成标准图谱并构建本地分离株S. aureus的鉴定数据库, 命名为Staphylococcus aureus。结果 经标准菌株ATCC 25923验证, 自建数据库对S. aureus鉴定结果的可信度较设备自带数据库明显提高, 鉴定分值由2.251提高到了2.845。自建数据库进一步对26株S. aureus进行聚类分型, 在差异水平100时, 24株不同来源S. aureus被聚类成24个分支, 将食品中不同来源分离的S. aureus分为24个型。结论 MALDI-TOF MS作为一种快速、准确、高通量的全新微生物鉴定技术, 实现了对S. aureus的特异性快速鉴定与分型, 能够满足公共安全卫生、突发食品安全事件和口岸快速通关方面的需求。