耐Mn~(2+)高产柠檬酸菌株的选育及其特性分析

诱变选育耐锰离子(Mn2+)的高产柠檬酸菌株,并研究了突变株的特性。采用紫外和亚硝基胍复合诱变,以含不同浓度Mn2+的培养基进行筛选,同时考察了不同浓度Mn2+对突变株柠檬酸发酵、关键酶酶活力及呼吸途径的影响。在以葡萄糖为唯一碳源进行摇瓶发酵时,突变株柠檬酸产量比野生菌株提高了92.4%,突变株UV-141对高浓度Mn2+有一定的耐受性,且Mn2+对其发酵生产柠檬酸有促进作用,与不添加Mn2+时相比,添加300 mg/L Mn2+时,柠檬酸产量及葡萄糖最大比消耗速率分别提高了107%和16.7%;乌头酸酶最高酶活下降了15.8%,NAD+-(NADP+-)异柠檬酸脱氢酶对Mn2+不敏感且在整个发酵过程中始终处于较低水平,有利于柠檬酸的积累;当侧系呼吸链(AOX)受到水杨基氧肟酸(SHAM)抑制时柠檬酸产量显著下降,而添加Mn2+则能够削弱其对柠檬酸产量的影响。突变株柠檬酸产量明显高于野生菌株,Mn2+能促进突变株葡萄糖代谢加快、乌头酸酶酶活下降,同时能削弱SHAM对AOX途径的影响,从而促进柠檬酸的大量积累。     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR的方法从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) 中扩增出3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因及侧翼序列 CgGPD1,分别构建了含不同 CgGPD1 拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1(Ⅰ)、pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1(Ⅱ)和pCAM3300-zeocin-CgGPD1 -CgGPD1-CgGPD1(Ⅲ).在大肠杆菌JM109中,研究了其在不同质量浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况.结果表明,在大肠杆菌中GPDH的活性随着NaCl、葡萄糖质量浓度的升高而增加.当NaCl质量浓度达到2.5 g/dL时,GPDH的酶活比在0.5 g/dL NaCl下平均提高31.2%; 当葡萄糖质量浓度提高至10 g/dL时,GPDH的酶活比2 g/dL葡萄糖下平均提高31.8%;在相同的NaCl、葡萄糖质量浓度下,GPDH的活性随着 CgGPD1 拷贝数的增加而升高,JM109(Ⅱ)比JM109(Ⅰ)的GPDH酶活平均提高8.2%,JM109(Ⅲ)比JM109(Ⅱ)的GPDH酶活平均提高9.9%.以上结果表明,在大肠杆菌中 CgGPD1 基因的表达同样受渗透压胁迫调节.     

固定化Amycolatopsis sp.ST2710分段发酵无锡他汀

用海藻酸钠对Amycolatopsis sp.ST2710细胞进行固定化处理。以固定化细胞的机械强度以及分段发酵无锡他汀的转化率为指标,考察了海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、固定化时间和包埋菌体量对固定化细胞分段发酵无锡他汀的影响,得到最佳的固定化条件为:海藻酸钠浓度20 g/L、CaCl2浓度10 g/L、固定化时间1 h、包埋菌体量2 mL菌悬液/10 mL凝胶。对固定化细胞分段发酵无锡他汀的特点进行了研究,结果显示:Amycolatopsissp.ST2710经过固定化处理后,大幅度提升了其对底物洛伐他汀的耐受性,显著降低了对发酵培养基中的淀粉需求量,可重复利用。当发酵两阶段pH分别为7.5和5.5、发酵时间分别为48 h和10 h、洛伐他汀添加量3 g/L、转化培养基中淀粉浓度15 g/L时,中间产物Ⅰ对洛伐他汀转化率为64%,无锡他汀对中间产物Ⅰ的转化率为75%。连续发酵5批后,产物转化率仍能维持较高的水平。     

一种米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶解特性研究

对米曲霉固态发酵所产蛋白酶分离纯化,采用硫酸铵盐析、DEAE-FF层析、Butyl-HP层析和Superdux 7510/300GL凝胶层析得到一种电泳纯的蛋白酶,SDS-PAGE显示分子量大小为27 ku左右。以酪蛋白为底物时,该蛋白酶Km=1.23 g·L-1,Vm=27.03μg·m L-1·min-1,最适反应条件为50℃,p H9.0。该蛋白酶对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低;对牛胰岛素B链上-Phe-Val-,-Cys-Gly-,-Glu-Ala-和-Arg-Gly-组成的肽键有较强的切割能力,酶切位点较多,对疏水性氨基酸具有较高的选择性,为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供有力的参考。      

根癌农杆菌介导酿酒酵母的遗传转化

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）可以将它的Ti质粒的一段T-DNA序列转化到广泛的宿主细胞并能整合到宿主染色体中.作者利用根癌农杆菌转化系统成功地实现了产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）乳清苷酸脱羧酶基因（Ura3）对酿酒酵母（Saccharamyces cerevisiae）W303-1A的Ura3缺陷遗传互补转化,转化率约为3.2个转化子/10^5个酵母细胞.通过转化子PCR和表型验证说明了T-DNA已经整合进入酵母染色体,并能够稳定地进行遗传表达.     

芭蕉芋糖化液酒精发酵条件研究

对芭蕉芋糖化液的三角瓶酒精发酵条件进行了研究。通过单因素实验和正交优化实验，确定种子培养基为含葡萄糖16．1％的芭蕉芋糖化液添加1％玉米浆和0．2％尿素，种子培养条件为33℃，15r/min摇床培养17h，接种量10％。发酵培养基为含葡萄糖16．1％2芭蕉芋糖液中尿素0．2％和玉米浆2％。发酵初始pH值4．3，33℃下静置发酵。在此发酵条件下可从16．1％的糖液中得到9．43％（v/v)的酒精，达到葡萄糖理论转化率的91．0％。     

产甘油假丝酵母反复分批发酵法生产甘油

研究了合成培养基和复合培养基中产甘油假丝酵母反复分批发酵法生产甘油。结果表明,当产甘油假丝酵母细胞在贫磷合成培养基、贫磷复合培养基和补充微量元素的贫磷复合培养基中分别回用13次、9次和14次时,甘油平均产量（或平均得率）的增量均超过15.0%,而甘油平均产率的增加达到37.0%以上。因此限制反复分批发酵培养基中磷含量有利于增强产甘油假丝酵母细胞合成甘油的能力。产甘油假丝酵母细胞在贫磷复合培养基中的回用次数少于贫磷合成培养基中的回用次数,其原因是贫磷合成培养基仅限制了磷源的用量,而贫磷复合培养基除限磷外,微量元素缺乏使菌体生长和甘油生产能力受到影响,回用次数减少。与传统分批发酵相比,产甘油假丝酵母反复分批发酵具有发酵周期短、不需反复培养种子、节省原料成本、形成副产物少以及节约能源动力消耗等优点,可以实现甘油高产量、高得率和高产率的相对统一,且易于放大到工业化生产水平。     

PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达

利用PCR技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因 gpd1 启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212- zoecin -PSc gpd1 -GUS,并将其电击转入酿酒酵母中.将构建成功的酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 基因工程菌分别在0.2,0.5,1.0 mol/L NaCl的盐胁迫下培养,首次通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测 gpd1 启动子的酶活表达.研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因 gpd1 启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异.证实了 gpd1 启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道.     

优化简并引物PCR克隆Candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段

为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD),对不同酵母和其他真核生物的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.glycerinogenes的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段,经过优化PCR反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPI)基因中约600 bp的保守核心片段.DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPI)基因相似性较高.     

强脉冲CO_2激光对红外材料的破坏现象

指出了强脉冲激光对红外材料的破坏作用,用实验证明强激光对红外材料的破坏分为烧蚀破坏和冲击破坏。当光功率密度低于大气的光学击穿阈值时,是烧蚀破坏。当光功率密度超过光学击穿阈值时,主要是冲击破坏。在我们的实验条件下,激光对红外脆性材料的相互作用结果表明,红外光学材料极易产生微裂纹或粉碎性破坏。其破坏效果与激光的单脉冲能量、功