食源性致病菌焦磷酸通用引物测序方法的建立

建立一种利用焦磷酸测序技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella)的方法。通过对4种菌16SrRNA的保守序列可变区的同源性分析,设计出一套适合焦磷酸测序的扩增引物和测序引物,通过可变区位点差异,利用一套通用引物同时鉴别4种食源性致病菌,测序结果与数据库比对判断细菌种属。结果表明:建立的检测方法可在4 h内完成对4种菌的鉴定,测序鉴定结果与国标的传统生化方法完全一致,焦磷酸测序技术可用于食源性致病菌的检测和鉴定。     

动物肌肉组织DNA的提取方法及实时荧光定量PCR检测

以生鲜羊肉、猪肉、鸡肉、牛肉、鸭肉为实验材料,采用SDS法、异硫氰酸胍法、试剂盒法提取动物肌肉组织基因组DNA,对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR检测。结果表明,试剂盒法提取的基因组DNA在浓度和纯度方面均优于SDS法和异硫氰酸胍法。通过对三种提取方法建立的标准曲线进行比较,回归系数(R2)按照质量排序为:试剂盒法≥异硫氰酸胍法>SDS法,扩增效率按照质量排序为:试剂盒法>异硫氰酸胍法>SDS法。三种提取方法的羊源性成分灵敏度检测,最低检出限均为80 pg/μL,但在低浓度检测时试剂盒法的相对标准偏差RSD为0.684%,小于异硫氰酸胍法0.734%和SDS法1.075%;猪源性成分灵敏度检测,SDS法的最低检出限为80 pg/μL,异硫氰酸胍法和试剂盒法的最低检出限均为16 pg/μL,但在低浓度检测时试剂盒法的相对标准偏差RSD为0.092%,小于异硫氰酸胍法4.640%;鸡源性成分灵敏度检测,SDS法和异硫氰酸胍法的最低检出限均为3.2 pg/μL,试剂盒法的最低检出限为640 fg/μL,明显高于SDS法和异硫氰酸胍法。综上所述,试剂盒法提取的基因组DNA更有利于运用实时荧光定量PCR技术进行食物掺假和物种鉴别工作。      

贝母属药用植物叶绿体基因组单核苷酸多态性位点生物信息学分析

目的分析贝母属药用植物叶绿体基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的分布特点、鉴别能力和应用价值,为中药材贝母精准鉴定方法的建立提供技术支撑。方法应用多重序列比对、SNP筛选、酶切位点分析等生物信息学分析手段,对贝母属6种药用植物的15条叶绿体基因组序列进行分析。结果贝母属叶绿体基因组DNA同源性达98.38%,通过分析共发现SNP位点4058个,其中川贝母类鉴别候选位点71个,瓦布贝母鉴别候选位点个25个,太白贝母鉴别候选位点个120个,浙贝母鉴别候选位点个79个,湖北贝母鉴别候选位点个61个,平贝母鉴别候选位点794个。结论叶绿体基因组SNP分子标记因其密度高、鉴别力强和便于分析的特点,具有较大的应用价值。     

应用微滴数字PCR技术快速检测食用菌中沙门氏菌

定量风险评估是整个风险评估体系的发展趋势和终极体现形式,而快速、准确、简便的定量技术则是保障整个体系顺利、有效完成的核心支撑。作者根据沙门氏菌inv A毒力基因序列,在前人对引物研究结果基础上,合成特异性引物和探针。以沙门氏菌标准菌株为研究对象,建立沙门氏菌微滴数字PCR的快速定量检测方法,并对其特异性、灵敏度、样品实测等关键指标与传统培养法进行对照验证。结果表明,所建立的微滴数字PCR方法具有较好的特异性,检测灵敏度可达到10~2CFU/m L,样品实测与传统国标法对比,二者符合率100%。所建立的沙门氏菌微滴数字PCR定量检测方法,可以快速、准确、直接地分析沙门氏菌的含量,无需构建质粒和标准曲线,避免了因标准曲线量值偏差而影响样品定值的准确性,所建立的方法为食源性沙门氏菌污染的快速定量检测提供了技术支撑,为微生物风险评估体系的完善奠定了基础。     

鲜食葡萄贮运期黑斑病害致病病原菌分离鉴定

目的 通过研究鲜食葡萄黑斑病害的致病病原菌分离和鉴定,为鲜食葡萄采后病害防控措施开发提供理论支撑。方法 选用贮藏后的马奶等4个鲜食葡萄品种为研究对象,用组织分离法对引起黑斑病害的病原菌进行分离纯化,在PDA培养基上,观察拟菌株形态以及菌丝和孢子形态特征,采用有伤和无伤活体接种健康果实,并观察其发病特征,应用ITS通用引物对病原菌DNA进行扩增并测序。结果 分离出3种优势致病菌(A,B和C),检出频率分别为75.0%,32.0%和42.11%。有伤和无伤活体接种均具有致病性,且有伤大于无伤。对比《真菌鉴定手册》,初步确定拟菌株A为链格孢霉,拟菌株B为灰葡萄孢霉,拟菌株C为拟茎点霉,采用rDNA-ITS序列分析法证实拟菌株A与KJ489375.1、GU190188.1的序列相似度达到99%,结合两者结果确定主要致病病原菌为链格孢霉属小孢子种。结论 明确引起鲜食葡萄贮运期黑斑病害的主要致病菌为链格孢霉属小孢子种。