新疆琐琐葡萄提取物抗流感病毒A(H1N1)亚型作用研究

目的对新疆琐琐葡萄提取物抗流感病毒A(H1N1)亚型作用进行研究。方法1.采用狗肾传代细胞培养法和MTT法研究新疆琐琐葡萄多糖、琐琐葡萄总黄酮、琐琐葡萄总三萜对抗流感病毒A(H1N1)型作用。2.采用Read-muench法计算流感病毒A(H1N1)型在狗肾传代细胞中的半数感染量。3.通过观察细胞病变(CPE)、计算细胞病变CPE抑制率、MTT法测定药物对细胞的保护率等来评价琐琐葡萄多糖、总黄酮、总三萜的抗流感病毒效果。结果琐琐葡萄总黄酮的最大无毒作用浓度(TC0)为20μg/ml,琐琐葡萄总三萜的TC0为1500μg/ml。体外细胞试验中,琐琐葡萄黄酮、多糖提取物表现出对病毒的直接抑制作用,但是琐琐葡萄三萜提取物和利巴韦林(阳性对照)此作用不明显。体外细胞试验中,琐琐葡萄黄酮、多糖、三萜提取物均表现出对感染细胞后病毒的抑制作用,三萜的抑制效果要强于黄酮和多糖,利巴韦林的抑制作用强于黄酮、多糖、三萜。结论新疆特色植物资源—琐琐葡萄提取物抗流感病毒A(H1N1)亚型的作用是多途径的,琐琐葡萄总黄酮、琐琐葡萄多酚、琐琐葡萄三萜分别表现出对流感病毒A(H1N1)亚型感染细胞前、感染细胞后的抑制作用,以及直接抑制作用...     

新甲型H1N1流感病毒检测试剂形成配套体系

军事医学科学院承担的新甲型H1N1流感病毒攻关研究日前取得重要进展：由该院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室自主研制的新甲型H1N1流感病毒诊断试剂盒形成了配套体系。据主持这项研究的病毒学专家介绍,这次成功研制的系列诊断试剂盒,具有配套准确、操作简便、快速管用的特点,能够基本满足各级各类医疗和防疫机构工作人员的检测需要。目前,这套试剂盒已开始批量组装。     

H5N1禽流感病毒蛋白对1F1TM基因家族转录的影响

干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,简称IFITM)通过抑制病毒进入细胞来保护细胞,使其免受多种病毒的感染。为了鉴定H5N1病毒本身和结构蛋白是否作为IFITM基因的新调节因子,通过试验探讨了H5N1病毒和结构蛋白对IFITM基因家族转录的影响。结果显示,H5N1病毒的NS1、M1、NP和PB2蛋白在A549细胞中增加了IFITM1、IFITM2和IFITM3表达,对HEK293T细胞没有影响,在HEK293T细胞和A549细胞上,没有发现H5N1病毒的HA和NA蛋白影响IFITM基因家族表达。即在H5N1禽流感病毒感染期间,NS1、M1、NP和PB2蛋白的过表达可以直接刺激IFITM1、IFITM2和IFITM3的上调,而呼吸系统的上皮细胞可能首先被影响,特别地,NP和NS1显示对IFITM基因家族的表达显示更显著的作用。     

Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选

目的筛选Vero细胞生长的最适低血清培养基,用于流感病毒的细胞培养。方法分别以MEM、M199、DMEM/F12、DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加5%、2%、1%的小牛血清传代培养Vero细胞,通过细胞形态观察、细胞计数及MTT法检测细胞的增殖活力筛选最适基础培养基;将流感病毒接种低血清适应的Vero细胞,检测病毒收获液的血凝效价及残留BSA含量,电子显微镜观察病毒形态。结果以DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加2%小牛血清培养的Vero细胞长势良好,细胞数量较多,增殖活力最强。低血清适应的Vero细胞培养的流感病毒血凝效价最高可达1∶512,平均值为1∶384;病毒液中的残留BSA含量约为正常血清培养条件下的1/18;病毒形态完整。结论成功筛选出Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基,为更具生物安全性的流感疫苗的研发奠定了基础。     

衍生毛细管气相色谱法测定流感病毒裂解疫苗中游离甲醛含量

目的采用衍生毛细管气相色谱法测定流感病毒裂解疫苗中游离甲醛含量,并进行验证。方法应用2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)衍生流感病毒裂解疫苗中的游离甲醛,对其衍生化条件进行优化后,采用毛细管气相色谱法直接进样测定。色谱条件:色谱柱为HP-5毛细管色谱柱,初始温度为150℃,保持1 min,以20℃/min的速率升温至250℃,保持10 min;检测器为电子捕获检测器,温度为350℃,尾吹60 ml/min;进样口温度为300℃,隔垫吹扫3 ml/min,分流比50∶1;载气为氮气,流量为2.5 ml/min;进样量1μl。确定建立的方法的检测限和定量限,进行线性、专属性、准确度、精密度及稳定性验证,并用建立的方法检测2个企业共11批样品中游离甲醛含量。结果确定的最佳衍生化条件为:量取对照品溶液和供试品溶液各1 ml,分别置15 ml离心管中,加入DNPH盐酸溶液1 ml,涡旋1 min;超声5 min;60℃衍生45 min;冰浴冷却,加入环己烷2 ml,涡旋萃取1 min;静置分层,收集上层液1 ml,注入气相色谱仪进行检测。该方法的最低检测限为0.1μg/ml,定量限为0.2μg/ml,游离甲醛含量在1~30μg/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.999 8);该色谱分离条件对甲醛的衍生物甲醛2,4-二硝基苯腙有较好的专属性;3个不同浓度样品平均加样回收率为107%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2.11%;对照品溶液连续进样6次的峰面积平均值为40 652.8,RSD为0.004%;甲醛衍生物溶液冻存7 h内的峰面积平均值为40 257.35,RSD为1.57%。11批流感病毒裂解疫苗的游离甲醛含量均符合《中国药典》三部(2010版)规定,均不高于50μg/ml。结论建立了衍生毛细管气相色谱法检测流感病毒裂解疫苗中游离甲醛含量,该方法操作简单,精密度、稳定性、准确度好,专属性强,可用于流感病毒裂解疫苗中游离甲醛含量的测定。     

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在动物体内诱导中和抗体水平及其过敏原性

目的评价甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在动物体内诱导的中和抗体水平及其过敏原性。方法将昆明小鼠随机分为7组,分别经腹腔注射3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗(剂量分别为15、30、45μg/0.5 ml)、3批季节性H1N1流感病毒裂解疫苗(剂量分别为15、30、45μg/0.5 ml)和PBS(阴性对照),每只0.5 ml,间隔21 d加强免疫1次,分别于免疫前、初次免疫后21 d及加强免疫后14 d采血,分离血清,采用固定病毒-稀释血清法检测小鼠血清中和抗体滴度。将豚鼠随机分为4组,分别经腹腔注射上述3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗和PBS(阴性对照)各0.5 ml,隔日注射1次,共3次,第1次注射后第14和21 d,分别经静脉注射同一批号的疫苗1.0 ml攻击,观察豚鼠的过敏反应。结果初次免疫后21 d,甲型H1N1流感病毒裂解疫苗15、30、45μg剂量组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为免疫前和阴性对照组的47.9、113.5和319.9倍,且呈剂量依赖性;加强免疫后14 d,甲型H1N1流感病毒裂解疫苗各剂量组中和抗体滴度比初次免疫后21 d均明显升高,也呈剂量依赖性,且均高于与相应剂量的季节性H1N1流感病毒裂解疫苗。甲型H1N1流感病毒裂解疫苗各剂量组豚鼠均无过敏反应发生。结论甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在昆明小鼠体内可诱导产生保护性中和抗体,对豚鼠无过敏反应。     

气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量

目的目的采用气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量,并对该方法进行验证及初步应用。方法采用气相色谱法定量测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中的乙醚含量,顶空条件:平衡温度为90℃,平衡时间为30 min。色谱条件:色谱柱:HP-FFAP毛细管色谱柱(25 m×0.32 mm×0.5μm);载气:氮气;流量:1.0~2.0 ml/min;进样口温度:160℃;检测器温度:250℃;柱温:45℃;分流比:5∶1;进样体积:1 ml。对建立的方法进行验证及初步应用,并建立质量标准。结果该方法检测乙醚残留量溶剂对所测组分无干扰;系统适应性良好;乙醚浓度在11~110μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好(r=0.999 3);最低定量限为0.028μg/ml;检测对照品溶液的相对标准偏差(RSD)为2.98%;加标回收率在83.08%~87.58%之间。应用该方法检测9批疫苗样品中的乙醚残留量在0.000 03%~0.000 55%之间,符合《中国药典》二部(2005版)附录ⅧP应不高于0.5%的要求。将乙醚残留量作为该疫苗半成品的质量标准检测项目,限度定为0.05%。结论气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量系统适用性、线性、精密性和准确性良好,且易于操作,简便快速,可用于甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚残留量的测定。     

四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量高效液相色谱检测方法的建立、验证及与比浊法的对比

目的 建立四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量高效液相色谱(high performance liquid chromatogra-phy,HPLC)检测方法,对方法进行验证,并与比浊法进行对比.方法 对HPLC法的流动相比例(水∶甲醇=30∶70、20∶80、10∶90)、流速(1.0、1.2、1.4...     

猪源副流感病毒5型SH毒株全基因组测序及分析

目的 对猪源副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5) SH毒株进行全基因组测序及分析.方法 根据GenBank中登录的猪源PIV5基因组序列设计10对引物,采用RT-PCR法对各片段进行扩增、测序,并对获得的PIV5-SH株全基因组序列进行遗传进化性分析.结果 PIV5-SH毒株基因组长1...     

乙型流感病毒感染过程中干扰素介导的天然免疫应答

目的 探讨乙型流感病毒(influenza B virus,IBV)感染引起干扰素(interferon,IFN)介导的天然免疫应答。方法以IBV感染犬肾上皮细胞(MDCK)为模型，通过荧光定量PCR法检测IFN信号通路的激活以及IFN刺激基因的表达。收集IBV感染MDCK细胞36及48 h上清，与新鲜培养基混合培养IBV感染MDCK细胞，qPCR法检测内源性IFN的抗病毒作用。加入JAK-STAT通路抑制剂CP后，收集IBV感染MDCK细胞上清，培养IBV感染MDCK细胞，通过qPCR法检测JAK-STAT通路抑制后对内源性IFN抗病毒作用的影响。结果 IBV可有效激活IFN信号通路，并诱导产生Ⅰ型IFN(IFNα、IFNβ)以及Ⅲ型IFN(IFNλ1、IFNλ3)为主的细胞因子。同时，IBV感染MDCK细胞后可诱导产生一系列具有广谱抗病毒作用的IFN刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)，如ISG15、CCL5、CXCL10、MX1、RIG-I。用JAKSTAT通路抑制剂CP抑制该信号通路后，IBV感染MDCK细胞所诱导生成的ISGs的能力及其相应的抗病毒作...