基于虚拟筛选的酸性磷酸酶抑制剂及其抑制机理

磷酸酶是参与水产品鲜味物质肌苷酸(IMP)的降解途径中的关键酶,以海鲈鱼肝中酸性磷酸酶为研究对象,通过同源建模、分子对接等手段,从中药化合物中虚拟筛选出ACP抑制剂,并研究其抑制机理。结果表明:苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氢白藜芦醇具有很强的抑制磷酸酶活性作用。选取抑制效果最好的十六烷二酸结合荧光光谱分析,结果表明:氢键和范德华力是十六烷二酸与ACP结合的主要驱动力,同时导致ACP荧光强度降低,最大发射波长红移。十六烷二酸与ACP的活性中心结合,使ACP二维和三维结构发生变化,降低了ACP与IMP的接触,可延缓IMP降解。     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

猪小肠粘膜碱性磷酸酶的分离纯化及性质研究

猪小肠粘膜经过Tris-HCl缓冲液(pH8.5)充分溶解、正丁醇除脂、冷冻离心、真空冻干等步骤处理后,先后经过Phenyl High Performance疏水层析/DEAE Fast Flow 阴离子层析/Sephacryl S-200凝胶层析纯化后得到猪小肠粘膜ALP(碱性磷酸酶),并对其蛋白二级结构及理化性质进行研究。结果表明:该酶经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离得到ALP蛋白带,分子量约为57.0 kDa。该酶纯化倍数为68.2,比活力倍数为19.1 U/mg。利用圆二色性光谱测定纯化后蛋白二级结构,发现α-螺旋3.6%、β-折叠41.8%、β-转角21.5%、无规则卷曲33.1%。ALP在催化底物对硝基苯磷酸二钠(p-NPP)作用下最佳温度30 ℃、最佳pH为9.5;金属离子对ALP起到激活的离子为Mg²⁺和Ca²⁺,起到抑制的离子为Zn²⁺和EDTA。     

腹泻性贝类毒素DSP的磷酸酶抑制检测法研究

对腹泻性贝类毒素DSP的快速筛选方法——磷酸酶抑制法进行了研究,分析了该方法的检测原理,并提出了该方法的筛选检出限,对标准溶液、加标回收样品及市场采样样品进行了检测,并就该方法的重复性进行验证。检测结果显示,磷酸酶抑制法检测准确率高,重复性较好,提出的筛选检出限(200μg/kg)远低于我国相关标准的规定(600μg/kg),是一种对于腹泻性贝类毒素DSP较为理想的筛选方法。      

哺乳动物不同种群蛋白磷酸酶基因家族的序列比较

蛋白磷酸酶(PPP)家族在体内参与调节多种重要的生理功能,包括细胞周期、细胞生长及分化等过程。通过对在信号转导中起着重要作用的PPP基因进行序列比对,研究人、猪、大鼠、小鼠以及大猩猩的PPP基因家族的进化。结果表明:除了ppp1r3a基因序列分化较晚,基因保守性略高外,其它蛋白磷酸酶基因家族序列分化较早,分支较大,但在分化后保守性高。     

异戊二烯对刺参急性毒性及其抗氧化酶和免疫酶活性的影响

为研究有机污染物对海洋生物的毒性影响,选择海洋环境中典型的异戊二烯作为暴露污染物,研究其对体质量为(5.23±0.96)g刺参Apostichopus japonicus的急性毒性及其体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响,并在实验室条件下,采用静水式生物毒性试验法开展了急性毒性试验,以及96 h亚致死效应的毒性试验。结果表明:异戊二烯对刺参的24、48、72、96 h半致死质量浓度分别为83.00、78.09、72.93、69.77 mg/L,安全质量浓度为6.98 mg/L;亚致死试验中,CAT活性受到的影响最大,表现为受到抑制作用,存在良好的剂量-效应和时间-效应正相关性;96 h时,中、低浓度异戊二烯对SOD活性具有显著的诱导作用(P<0.05),而高浓度异戊二烯对SOD活性具有极显著的抑制作用(P<0.01);ACP和AKP活性受到的影响较小,但48 h时两种酶均受到极显著的诱导作用(P<0.01),96 h时AKP活性受到显著的诱导作用(P<0.05);随着异戊二烯质量浓度的增加和时间的延长,刺参体腔液中4种酶活性受到不同程度的影响,因此,异戊二烯胁迫对刺参体内产生自由基导致氧化胁迫效应,以及对消化、能量代谢系统的影响可能是其重要的致毒原因,刺参体腔液中4种酶的变化体现了异戊二烯的致毒机制。本研究结果可为异戊二烯对海洋生物的生态毒理学方面的研究提供参考依据。     

基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

本研究构建了分别含有烟酰胺核苷激酶（nicotinamideribosidekinase,NRK）和多聚磷酸酶（polyphosphatekinase,PPK）的双菌耦合发酵体系，实现了基于PPK的ATP再生系统在烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）生产中的应用。首先分别构建表达NRK1和NRK2的工程菌株，筛选得到高活性的大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)-pET28a-NRK1,NMN产量5.17 g/L，产率77.4%；然后对NRK1的诱导表达条件进行优化，发现低温16℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.7 mmol/L、接种量3%、诱导时长22 h更利于蛋白的可溶性表达；进一步对E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系进行探索，发现在菌体质量浓度100 g/L、温度18℃、时间12 h、ATP与烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）浓度比1∶1.5时，NMN产量最高为5.73 g/L，产率85.78%；最后，通过对E. coli BL21(...     

引江济太对太湖水体碱性磷酸酶活性的影响

本文通过对2003年7—9月引江济太期间太湖水体中碱性磷酸酶活性的测定．以及总磷、总氮、正磷酸盐和叶绿素等其它水化学因子的同步监测，初步探讨了太湖水体在引入长江水之后，其碱性磷酸酶活性、营养盐和叶绿素含量的变化趋势，以及碱性磷酸酶活性与营养盐、叶绿素含量之间的关系。研究表明：(1)调水期间，碱性磷酸酶活性的最大反应速率(Vmax)值降低，而米氏常数(Km)值普遍增高，表明引入长江水后，太湖水体碱性磷酸酶的总催化效率降低；(2)太湖水体碱性磷酸酶的Vmax/Km与叶绿素含量之间具有良好的相关性．叶绿素含量随着酶活性的降低而降低。     

BQC法与COC法测定乳品中ALP活度的比较

在弱碱条件下，磷酸酚二钠会被碱性磷酸酶(ALP)催化水解生成苯酚，苯酚在硫酸铜的催化下能同显色剂2，6-二氯醌氯亚胺(CQC)或2，6-二溴醌氯亚胺(BQC)反应生成稳定的蓝色靛酚，测定兰色靛酚定吸光度，并与标准系列比较定量，就可测定各类乳品中ALP活度，这两种方法可用于区别生鲜乳品和巴氏杀菌乳品，并可有效判定乳制品巴氏杀菌的效果。本文比较了BQC法与CQC法测定乳品的ALP活度，结果显示选择2，6-二氯醌氯亚胺(CQC)作显色剂较为理想。