多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的 4个血清型

目的建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法。方法根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的灵敏度和特异性。使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性。同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌。结果本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR方法, PCR循环参数中退火温度为60℃,扩增片段分别为249、353、890和587 bp。多重PCR直接检测O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于10~3～10~4 CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1CFU/m L。多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带。当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45%(3/55),主要为O26、O145血清型;增菌后检测阳性率为7.27%(4/55),主要为O26、O145和O121血清型。阳性PCR扩增样品,成功分离到O26两株、O145和O121各一株。分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性。结论以STECO26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR方法,灵敏度和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌。     

2016年江苏省淡水养殖环节常见致病性弧菌污染状况调查

目的 了解江苏省淡水动物性水产品养殖环节中常见弧菌(副溶血性弧菌、霍乱弧菌等)的污染程度。 方法 参照《2016年国家食品安全风险监测淡水动物性水产品养殖环节中常见弧菌专项监测工作手册》进行样品的采集和检测。 结果 从淡水养殖场中采集水产品、水体、水底沉积物样品共507份, 检出副溶血性弧菌17株(3.4%); 霍乱弧菌4株(0.8%); 溶藻弧菌及创伤弧菌均未检出。检出的副溶血性弧菌均不携带毒力基因(trh-;tdh-), 主要血清型为O5:H7(41.2%), 主要耐受的抗生素为头孢唑林(94.1%), 其中3株PFGE带型相似性系数100%; 4株霍乱弧菌均为非O1/O139群, 未发现耐药株。结论 江苏省淡水养殖环节中副溶血性弧菌环境污染程度低, 但在淡水养殖环节中检出致病性弧菌, 提示淡食用水产品依然可能存在引发食物中毒的风险。     

肉鸡屠宰场多重耐药沙门氏菌Ⅰ类整合子与磺胺类耐药基因（sul1、sul2和sul3）的检测

目的：了解肉鸡屠宰场多重耐药沙门氏菌Ⅰ类整合子及磺胺类耐药基因携带情况。方法：采用纸片扩散法对肉鸡屠宰场84 株沙门氏菌分离株进行10 种抗生素敏感性实验;应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法检测多重耐药沙门氏菌sul1、sul2、sul3和int1基因。结果：84 株沙门氏菌对氨苄西林和萘啶酸耐药率高达100%,对环丙沙星、四环素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、大观霉素、氟苯尼考、庆大霉素耐药率分别为39.29%、35.71%、35.71%、35.71%、22.62%、14.29%。38 株沙门氏菌对3 种及以上抗生素耐药,属于多重耐药菌株。38 株多重耐药菌株中,有20 株携带Ⅰ类整合子。30 株对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐药的菌株中,均能检测到sul1或sul2或sul3基因,与表型耐药100%符合,其检出率分别为40%、100%、63.3%。结论：肉鸡屠宰场中沙门氏菌耐药现象已不容乐观,沙门氏菌多重耐药性与Ⅰ类整合子的携带之间关系密切,且Ⅰ类整合子在磺胺类耐药菌株的产生中起到重要作用。     

顺铂对人肺腺癌细胞作用与ERCC1、Bcl-2表达的相关性研究

目的: 探讨ERCC1、Bcl-2表达与顺铂作用的关系,进而推测ERCC1、Bcl-2在顺铂耐药中的作用。方法: 选择人肺腺癌细胞A549及其耐DDP细胞株A549/DDP作为研究对象,采用MTT法检测A549/DDP细胞耐药指数;免疫细胞化学方法、RT-PCR方法检测不同浓度、不同作用时间干预后细胞中ERCC1、Bcl-2的表达。结果: 10 μg/mL DDP作用 12 h,A549细胞中ERCC1、Bcl-2 mRNA表达开始增高,随着作用时间的延长,ERCC1、Bcl-2 mRNA的表达逐渐增高,在 72 h 表达最强。浓度为 5 μg/mL 的DDP即可刺激A549细胞中ERCC1、Bcl-2 mRNA表达水平上升,随着DDP浓度的增加,其表达水平逐渐上升,ERCC1民mRNA表达水平在 20 μg/mL 组达到高峰。与亲本细胞相比,A549/DDP中ERCC1、Bcl-2表达明显增高。结论: 随着顺铂作用时间的延长和浓度的增加,A549细胞中ERCC1、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达量增加,推测ERCC1、Bcl-2 可能参与了顺铂继发耐药的形成。     

发酵用鲜辣椒中乳酸菌抗生素耐药性与耐药基因

以四川泡菜发酵用的新鲜二荆条辣椒表面上附着的乳酸菌为研究对象,分析其对四环素(TET)、链霉素(STR)和红霉素(ERY)的耐药性与耐药基因。研究表明:用于发酵的鲜辣椒中,乳酸菌的含量约为2.18×104CFU/g,属于Weissella cibaria(61.93%)、Lactococcus lactis(16.06%)、Enterococcus mundtii(5.50%)、Enterococcus faecalis(3.67%)、Enterococcus hirae(3.67%)、Leuconostoc mesenteroides(6.88%)和Leuconostoc holzapfelii(2.29%)。所有218株分离株均无ERY耐药,但其中30株(13.76%)表现出TET和STR耐药,包括10株W.cibaria(4.59%)、2株Lac.lactis(0.92%)、1株E.mundtii(0.46%)、2株Leu.mesenteroide(0.92%)和1株Leu.holzapfelii(0.46%)STR耐药菌株,9株W.cibaria(4.12%)、2株Lac.lactis(0.92%)、1株E.faecalis(0.46%)和2株E.hirae(0.92%)TET和STR二重耐药菌株;除TET和STR二重耐药菌株W.cibaria CT024中未检出任何TET被检基因外,其它耐药株都有相应1个或多个被检基因被检出。其中,在5种STR被检耐药基因中,str B的检出率最高,达60.00%;aad6的检出率最低,为16.67%。11种TET被检耐药基因中,tet B和tet C的检出率最高,达到85.71%;tet Z的检出率最低,为7.14%。同时,同种内的不同菌株对STR或TET的耐药性高低与耐药基因的种类和数量多少无相关性。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制及呼吸机相关性感染的流行病学分析

目的: 探讨碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia, CRKP）耐药机制及临床分离株与呼吸机分离株之间的遗传相关性。方法: 收集41株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌,其中28株为临床分离株,13株为呼吸机分离株。改良Hodge试验检测碳青霉烯酶,亚胺培南/EDTA结合（DDTs）及协同（DDST）试验检测金属酶,双纸片增效试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）,纸片扩散法检测药敏试验,E-test检测肺炎克雷伯菌对替加环素的MIC。PCR检测耐药基因,产物测序,确定其基因型。采用多位点序列分型（MLST）对CRKP进行分子遗传学分析。 结果: 所有菌株改良Hodge试验均阳性,基因检测均为blaKPC-2;只检测到一株菌产金属酶,基因型为blaNDM-1;未检测出blaGES、blaVIM、blaSPM、blaIMP及blaOXA等其它碳青霉烯酶基因。ESBLs检出率为 43.90%,但所有菌株均携带β-内酰胺酶基因,以blaCTX-M-24为主（92.68%, 38/41）,其次为blaSHV-12（78.05%, 32/41）。38株携带blaTEM中,其中35株为广谱blaTEM-1,只有3株为超广谱blaTEM-104。所有菌株均检测出外膜蛋白ompk35基因,95.12%的菌株有外膜蛋白ompk36基因。28株临床分离株大部分来自ICU病房（67.86%, 19/28）,其中有24例感染患者使用了呼吸机;41株CRKP对临床常用的18种抗菌药物中100%耐药的有9种,耐药率最低的为四环素类,分别为替加环素（2.44%, 1/41）,米诺环素（7.32%, 3/41）和四环素（14.63%,6/41）。MLST结果显示,所有呼吸机分离株均属ST11型,28株临床分离株有25株也属ST11型,2个新的ST型已被Pasteur MLST数据库确认收录并分别命名为ST1854和ST1855。结论: CRKP多重耐药情况非常严重,携带blaKPC-2基因是其碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因,存在ST11型肺炎克雷伯菌播散,且与呼吸机传播有关。     

中药单体白花丹醌对鲍曼不动杆菌的耐药逆转作用

目的: 探索中药单体白花丹醌对临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性的逆转作用。方法: 取临床分离的鲍曼不动杆菌53株,检测其对临床常用的14种抗菌药物的敏感性。观察中药单体白花丹醌对标准菌株的直接作用。在确定白花丹醌以及羰基氰化氯苯腙(CCCP)的工作浓度以后,观察对比白花丹醌与阳性药CCCP的外排抑制试验结果。结果: 临床分离的53株鲍曼不动杆菌对临床常用的14种抗菌药物耐药率较高,其中氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢西丁耐药率最高,分别为100%、100%、98.1%、98.1%。其余药物耐药率也均在50%以上。白花丹醌对标准质控菌的直接抗菌作用较弱。而白花丹醌与CCCP均显示了对庆大霉素、诺氟沙星、米诺环素和氯霉素的增敏作用,其外排阳性率分别达 11.3%和 18.9%,3.8%和 7.5%,13.2%和 17.0%,28.3%和 20.8%,两组之间无统计学差异(P>0.05)。结论: 鲍曼不动杆菌临床耐药情况严重,而白花丹醌作为一种中药单体可能具有一定的耐药逆转作用。     

异常生鲜乳中肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药分析

通过实验室常规纯培养方法对4份异常生鲜乳样进行分离培养、16S rRNA基因序列鉴定及小鼠致病性试验,选择16种抗生素用圆纸片扩散法(K-B法)对分离株进行测试,检测耐药基因。结果显示,成功分离出2株肺炎克雷伯氏菌;该分离菌株具有多重耐药性,在β-内酰胺类抗生素耐受的菌株中,检测到bla_TEM、bla_SHV、bla_CTX-M基因,在喹诺酮类抗生素耐受的菌株中,只检测到aac(6’)-Ib、oqx AB基因;在磺胺类抗生素耐受的菌株中,只检测出sul1、sul2基因;在氨基糖苷类抗生素耐受的菌株中,只检测出aacC2、aph(3’)-Ia基因;在四环素类抗生素耐受的菌株中,只检测到tet(A)基因;对小鼠致病性较强,被感染小鼠的肝脏、脾脏和肺脏均有不同程度的出血。研究表明,采自南疆某乳品企业生产的生鲜乳中存在肺炎克雷伯氏菌污染,该试验结果对于企业分析污染源,建立科学、精确的防控微生物污染体系提供参考依据。     

熟肉及速冻米面食品中变形杆菌污染状况及耐药特征分析

目的了解石家庄市市售熟肉制品和速冻米面食品中变形杆菌的污染状况,进一步研究菌株产超广谱β-内酰胺酶和对抗生素的耐药性。方法采取石家庄市市售熟肉制品和速冻米面食品进行变形杆菌分离培养,用BD Phoenix专家系统对所分离出的菌株进行鉴定和药敏试验。结果 377份样品中共有83份检出变形杆菌,总污染率为22.0%。其中熟肉制品、生制速冻米面食品和熟制速冻米面食品变形杆菌污染率分别为20.8%(32/154)、28.7%(43/150)和11.0%(8/73);变形杆菌计数范围为10~3~10~9cfu/g。药敏结果显示,80株奇异变形杆菌除对四环素和多粘菌素存在天然耐药外,对氨苄西林耐药率最高(36.3%,26/80),其次是头孢唑林(27.5%,22/80);3株普通变形杆菌除对四环素、多粘菌素、氨苄西林和头孢唑林存在天然耐药外,且均对氯霉素耐药。所有菌株均对阿米卡星、美罗培南、哌拉西林敏感。所分离的奇异变形杆菌中,有25.0%~33.3%产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs);多重耐药(MDR)菌株占12.5%~33.3%。结论石家庄市市售熟肉及速冻米面食品中变形杆菌污染较严重,分离株产ESBLs和MDR水平较高,有潜在引起食源性疾病的风险。     

一起食物中毒病原菌斯坦利沙门菌的分子分型及耐药性分析

目的对引起跨区域食物中毒的斯坦利沙门菌分离株进行耐药性检测和分子分型分析,追溯并明确病因食品,为该菌防控工作提供科学依据。方法采用微量肉汤稀释法对15株斯坦利沙门菌进行18种抗生素敏感性试验,同时对菌株基因组DNA经限制性内切酶Xba I酶切后进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型,并与数据库中其他沙门菌比较。结果此次疫情分离菌株中食品分离株和腹泻患者分离株血清型一致,耐药谱基本一致。经PFGE溯源分析后具有100%同源的PFGE带型,数据库中无相同带型的菌株。结论本起跨区域食物中毒是由斯坦利沙门菌污染的煮花生引起,分离菌株对红霉素耐药,对氯霉素处于中介,对其他抗生素敏感。