双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。     

去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞的分化

目的观察去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向上皮细胞的分化,并探讨其机制。方法从胎儿四肢长骨分离BMSCs,扩增后采用流式细胞术分析第3代(P3)细胞表面抗原(CD29、CD34、CD71和HLA-DR)的表达,并用4,6-乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)标记第4代BMSCs(P4-BMSCs)。机械法去除正常胎盘羊膜上皮,制成去上皮羊膜,并制备去上皮羊膜浸提液。将DAPI标记的BMSCs接种于羊膜上,设加或不加表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、类胰岛素1号生长因子(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)、羊膜浸提液诱导组及细胞爬片对照组,体外诱导培养后,采用免疫荧光组织(细胞)化学染色学法检测各组细胞角蛋白(Cytokeratin,CK)、EGF-R和IGF-1-R的表达,并于诱导后第10天计算CK阳性细胞率。结果原代BMSCs呈典型旋涡状生长,P3细胞表达CD29和CD71,不表达CD34和HLA-DR。羊膜组和细胞爬片组BMSCs在加入EGF或IGF-1诱导后,表达EGF-R和IGF-1-R的时间较未加生长因子的对照组提前2～4 d,表达CK的时间提前2～6 d,单用羊膜组或羊膜浸提液组的表达时间差异无统计学意义(P>0.05);诱导第10天,单用羊膜或羊膜浸提液诱导组的CK阳性细胞表达率明显高于细胞爬片对照组(P<0.05);羊膜与EGF、IGF-1联合诱导组高于单用羊膜组(P<0.05);EGF诱导组高于IGF-1诱导组(P<0.05)。结论羊膜及羊膜浸提液、外源性EGF和IGF-1在体外均可诱导BMSCs向上皮细胞分化,羊膜可能主要通过其所含的细胞因子诱导BMSCs向上皮分化。     

川芎嗪对雪旺细胞神经生长因子合成与分泌的影响

目的观察川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)对雪旺细胞(Schwann cells,SCs)合成与分泌神经生长因子(Nervegrowth factor,NGF)的影响,探讨其促进周围神经损伤修复的可能机制。方法采用DMSO溶解TMP,将SCs分为正常对照、溶媒对照组和不同浓度TMP组(终浓度分为25、50、100和200μg/ml),作用24 h后,通过MTT法和流式细胞术分析TMP对SCs增殖和凋亡的影响,Real-Time PCR与ELISA法分别检测TMP在mRNA和蛋白质水平对SCs合成与分泌NGF的影响。结果 TMP对SCs的增殖活力及凋亡均无影响。溶媒对照组、25、50μg/ml TMP组NGF基因mRNA水平和细胞培养上清中NGF含量与正常对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);100、200μg/ml TMP组与正常对照组相比明显增高(P<0.05),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TMP可促进SCs合成与分泌NGF,且该作用具有浓度依赖性,这可能是其促进神经损伤修复的机制之一。     

非灌流法分离大鼠肝星形细胞及其鉴定

目的采用非灌流法分离大鼠肝星形细胞(Hepatic stellate cell,HSC),并进行鉴定。方法采用非灌流法结合酶消化法分离大鼠肝脏细胞,密度梯度离心进一步分离HSC,油红染色检测HSC胞质中的脂滴,免疫组化法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、结蛋白(Desmin)及神经胶质酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达。结果非灌流法结合酶消化法可成功分离大鼠HSC;密度梯度离心纯化的HSC经油红染色,细胞核周围可见红色脂滴;该细胞中α-SMA、结蛋白及GFAP的免疫组化染色结果均呈阳性,细胞着色率可达90%以上。结论成功建立了大鼠HSC的非灌流分离模式,所获得的HSC纯度较高,该方法稳定简便,具有一定的推广应用价值。     

红球菌H-412生长细胞脱除正十六烷中的有机硫

利用实验室筛选的能够通过“4S”途径进行脱硫代谢的红平红球菌H-412(Rhodococcus sp.H-412)作为生物脱硫催化剂,二苯并噻吩(DBT)为含硫模型化合物,考察了红球菌H-412生长细胞脱除正十六烷中有机硫的脱硫性能.在油相体积分数20％的反应体系中,相同浓度的生长细胞比休止细胞的脱硫效率高.利用红球菌H-412生长细胞在油相分率20％的情况下,初始发酵液菌体浓度为0.048 g/L,初始DBT浓度为0.25 mmol/L的条件下分批培养的脱硫效率较高,达到了57％.红球菌H-412生长细胞在油相体积分率分别为0,5％,10％和20％条件下进行脱硫,DBT的消耗量及二羟基联苯(2-HBP)的生成量随油相体积增加而增大,20％条件下均达最大值,脱硫效率最高.细胞生长量随油相体积增大而减少,无油存在的条件下,细胞生长量最大.     

The Effect of Selected Electrospinning Parameters on Molecular Structure of Polycaprolactone Nanofibers

The effect of electrospinning parameters on morphology, molecular, and supermolecular structure of polycaprolactone (PCL) fibers was analyzed, with respect to tissue engineering applications. Fibers morphology and structure are mainly determined by solution concentration and collector type. Applied voltage does not significantly influence supermolecular structure (crystallinity) and mechanical stiffness. There is correlation between changes in structure and proliferation of 3T3 cells as evidenced by in vitro study. Processing window of optimal scaffolds is relatively wide, however, variation of electrospinning parameters do not significantly affect their biological functionality.     

Cellular Response of Limbal Stem Cells on Poly (Hydroxybuthyrate-co-Hydroxyvalerate) Porous Scaffolds for Ocular Surface Bioengineering

The aim of this study was to develop a modified-porous poly (3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyvalerate) (PHBV) scaffold for limbal stem cell (LSC) expansion that can serve as a potential alternative substrate to replace human amniotic membrane. The human limbal stem cell was used to evaluate the biocompatibility of substrates (porous scaffold, human amniotic membrane and thermoresponsive substrate) based on their viability, proliferation, and attachment ability. Biocompatibility results indicated that the all substrates were highly biocompatible, as LSCs could favorably attach and proliferate on the scaffold surface. Microscopic figures showed that the human limbal stem cell was firmly anchored to the substrates and were able to retain a normal corneal stem cell phenotype. Microscopic analyses illustrated that cells infiltrated the porous scaffold and successfully formed a three-dimensional corneal epithelium, which was viable for two weeks. Gene expression results revealed no change in the expression profile of LECs grown on scaffold when compared to those grown on human amniotic membrane or thermo responsive substrate. In addition, porous PHBV substrate provides not only a milieu supporting LSCs expansion, but also serve as a useful alternative carrier for ocular surface tissue engineering and could be used as an alternative substrate to amniotic membrane.     

蒙古国煤在捣固炼焦中的试验研究

蒙古国煤储量丰富,价格低廉,黏结指数在50左右。为了合理使用蒙古国煤,降低配煤成本,利用40kg试验焦炉对其进行捣固炼焦试验研究。研究表明,蒙古国煤具有较高的反应活性,单独炼焦后焦炭反应性高,反应后强度低;在基础煤较好条件下,使用20%左右的蒙古国煤,可炼制M40≥80%、M10≤7%、CRI≤30%、CSR≥60%的焦炭。     

人肺癌ILK基因siRNA重组表达质粒的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的构建人肺癌整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)基因siRNA重组表达质粒,并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列,克隆至载体pGenesil-1中,构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK,利用脂质体转染A549细胞,经G418稳定筛选后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞中ILK基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组表达质粒pGenesil-1-ILK经SalⅠ单酶切及测序证明构建正确,其转染A549细胞后,细胞ILK基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),且细胞的增殖能力也显著降低(P<0.05)。结论成功构建了人ILK基因siRNA重组表达质粒,ILK基因沉默可显著抑制A549细胞增殖,为肺癌靶向基因治疗的研究提供了新的思路。     

百日咳黏附素的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达百日咳黏附素(Pertactin,Prn),并制备抗Prn单克隆抗体。方法从无细胞百日咳疫苗生产菌株CS株基因组DNA中克隆Prn基因,插入表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-Prn,转化E.coli M15,IPTG诱导表达。表达的重组Prn蛋白经阳、阴离子交换层析纯化后,采用Western blot和ELISA法鉴定重组Prn蛋白的反应原性。以纯化的重组Prn蛋白为免疫原,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对制备的单抗进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组Prn蛋白相对分子质量约为69 000,主要以包涵体形式表达;纯化的重组Prn蛋白的纯度达95%以上,产量可达25 mg/L,能与不同来源的抗Prn-Ab血清特异性结合。获得2株分泌抗Prn单抗的杂交瘤细胞株,分泌的单抗均为IgG1类,轻链类型均为κ,效价均达1∶105以上,并能特异性识别Prn蛋白,而与百日咳杆菌其他抗原蛋白无交叉反应。结论原核表达、纯化了重组Prn蛋白,并制备了2株效价高、特异性强的单抗,为无细胞百日咳疫苗的质量控制及百日咳杆菌致病机制的研究提供了材料。