阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。     

婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的3种分型方法

阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿食品可能导致新生儿和婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,对其健康造成严重威胁。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和肠杆菌间保守重复序列PCR(ERIC-PCR)对分离于婴幼儿配方乳粉、米粉和辅食中的阪崎克罗诺杆菌进行分子分型,计算3种分型方法的辛普森多样性指数(DI)值,评价3种方法的分型效率,以便精确和快速开展阪崎克罗诺杆菌流行病学研究。PFGE、MLST和ERIC-PCR可分别将37株阪崎克罗诺杆菌分为35个PFGE基因型、28个ERIC-PCR型和23个序列(ST)型,分型结果的DI值分别为99.55%,96.40%和98.05%。3种方法对阪崎克罗诺杆菌均具有较高的分型能力,其中PFEG分型能力最高,分型效率最佳。     

基于电沉积石墨烯阪崎肠杆菌免疫传感器研究

为研制一种新型免疫传感器并用于快速检测阪崎肠杆菌(E.sakazakii),采用自组装方法将辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体(HRP-anti-E.sakazakii)固定于修饰有电沉积石墨烯(ERGO)的丝网印刷碳电极上,制得一次性酶免疫传感器。采用循环伏安法(CV)考察不同修饰电极的电化学特性,根据CV还原峰电流值的变化对E.sakazakii进行快速检测。在优化的检测条件下,该方法检测E.sakazakii的线性范围为102～109cfu/mL,检测限为9.1×101cfu/mL(S/N=3)。该酶免疫传感器灵敏度高,并具有良好的特异性、重现性(RSD=6.4%)、稳定性(4℃无菌容器中放置15d后电流响应为初始值的90.05%),具有一定潜在应用价值。     

应用DiversiLab分型系统对奶制品中的阪崎肠杆菌进行同源性分析

为研究奶制品污染中阪崎肠杆菌的同源性关系,并建立起阪崎肠杆菌基于重复序列的分型技术。对2005-2006年福建省出入境检验检疫局从各类奶制品中分离出的阪崎肠杆菌先进行API鉴定,然后进行DiversiLab分型。其中DiversiLab分型包括:DNA提取,rep-PCR和微电泳芯片分离检测。rep-PCR条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,70℃延伸90 s,35个循环;最后70℃延伸3 min。结果表明:31株阪崎肠杆菌被API分成了5种不同的生物型,DiversiLab分型能将阪崎肠杆菌分为不同的亚型,但它们之间没有必然的联系。部分同一企业来源的菌株具有同源性,样品的同源性与采样地无关。DiversiLab分型系统是一种快速,高效,易于操作,高重复性,高分辨率的基因分型方法,可作为食源性污染的同源性分型工具。     

含双歧杆菌的婴儿配方奶粉和原料中阪崎肠杆菌的检测

对按照GB 4789.40方法,检测含双歧杆菌的婴儿配方奶粉和原料中的阪崎肠杆菌进行了研究,发现检测结果存在假阴性风险。对检测方法进行了改进,通过添加万古霉素,或增大BPW稀释液的用量,降低了双歧杆菌对阪崎肠杆菌的抑制作用,从而避免了检测结果的假阴性,保证了婴儿配方奶粉的质量与安全。     

羊奶粉生产环节阪崎肠杆菌分离鉴定及其毒力基因和药敏检测

目的:分析羊奶粉生产环节阪崎肠杆菌的污染状况,分离株毒力基因携带情况以及耐药性。方法:采自某羊奶粉加工厂空气过滤车间、液态奶车间、流化床车间、喷雾干燥车间和包装车间的生产样品及环境样品共180份,按国标GB4789.40-2010和PCR方法进行阪崎肠杆菌的分离鉴定;采用PCR方法检测cpa、hly、sip和omp X毒力基因;采用琼脂稀释法测定药敏性。结果:27个采样点中有14个阪崎肠杆菌阳性点,检出率为51.9%;180份样品中有29份检出阪崎肠杆菌,污染率为16.1%;阳性样品主要为粉状和棉签涂抹样品,污染率分别为23.5%和16.9%。毒力基因检出率为100%,毒力基因类型有cpa-omp X和cpa-hly-omp X,检出率分别为79.3%,20.7%。29株菌对利福平、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、头孢西丁钠、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸的耐药率依次为100%,75.9%,6.9%,3.4%和3.4%;对其它11种抗生素均敏感,多重耐药率为6.9%。结论:羊奶粉加工厂存在阪崎肠杆菌的污染。空气流动、粉尘污染、操作人员交叉污染及生产设备清洗消毒不彻底可能是加工过程中该菌的污染途径。分离株毒力基因携带率较高,对大多数供试抗生素敏感,出现多重耐药现象。     

蓝光对阪崎肠杆菌的杀菌及机制研究

本文以食源性致病菌阪崎肠杆菌为对象,研究了医学领域抗细菌感染蓝光的杀菌作用,并首次对其杀菌机制进行了探究。结果表明,当蓝光剂量大于30 J/cm~2时,对阪崎肠杆菌具有显著杀菌作用,照射剂量达240 J/cm~2时,杀菌率超过8 log 10 CFU。亚致死剂量(0～30 J/cm~2)蓝光照射下,单线态氧(~1O_2)探针SOSG开始出现绿色荧光信号,显示细胞内1O2涌现并造成细胞外壁微小孔洞;活性氧物质(ROS)也迅速产生并逐渐增大至5 a.u.;随后脂质氧化标志物丙二醛(MDA)逐渐增加,显示细胞内产生脂质氧化。上述胞内物质变化导致细胞外膜受损,30 J/cm~2蓝光下细胞外膜渗透性增加了48.96%;此外脂肪酰基谱测定揭示,不饱和脂肪酸C18:2,C16:1和C18:1含量减少并逐渐消失,很可能是细胞外膜损伤的重要原因之一。本研究确证了蓝光下细菌胞内~1O_2、ROS及脂质氧化物的动态变化,更重要是的,揭示了细胞外膜损伤是蓝光杀菌的重要方式之一,因为细菌脂质尤其是不饱和脂肪酸是蓝光杀菌重要靶标,本研究将有助于蓝光杀菌机制的深入探究。     

基于内参系统的阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据阪崎肠杆菌ompA靶基因设计特异性引物和探针,并加入内参(IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法对阪崎肠杆菌基因组DNA的最低检测限为1pg;对细菌的最低检测限为1×10~4 CFU;对含有靶基因质粒的最低检测限为10~3拷贝;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R~2=0.999)。人工污染试验结果表明,在初始菌量为10CFU/25g奶粉样品时,采用水洗加试剂盒法和水煮法提取DNA,阪崎肠杆菌均在增菌10h时检出。研究结果为进一步优化和完善阪崎肠杆菌分子生物学方法的标准化提供了参考。     

建立一种快速检测坂歧肠杆菌的方法

目的:建立快速检测婴儿配方奶制品(IFM)中坂歧肠杆菌的方法。方法:选择ATCC坂歧肠杆菌标准株,对不同的增菌性培养基、选择性培养基和显色培养基进行研究;结合VITEK仪和API20E细菌鉴定系统,构建快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法。结果:建立的快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法,所需检验流程为72h,方法灵敏度为2CUF/g,能有效区别于阴沟杆菌、产气杆菌等肠杆菌科细菌;方法应用稳定;操作简单、方法可靠,适宜规模化检测。结论:本研究认为,所建立的快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法适宜检验检疫的工作要求,能有效地发现配方奶制品中坂歧肠杆菌的污染情况。     

奶粉中坂崎肠杆菌检测方法研究进展

坂崎肠杆菌为肠杆菌科肠杆菌属，奶粉（尤其是婴幼儿配方奶粉）中坂崎肠杆菌的污染可引发严重的公共卫生问题，其主要检测方法包括传统的细菌学培养方法及各种基于聚合酶链式反应（PcR）的分子生物学检测方法，改进的培养方法和快速特异的分子生物学方法已成为坂崎肠杆菌检测的重要发展方向。