4种金属离子亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的效果比较

对利用金属离子亲和层析纯化重组类人胶原蛋白过程中使用的金属离子进行了比较,从而对分离纯化的条件进行优化。在相同实验条件下,用4种金属离子柱分离纯化目的蛋白。结果显示,经4种金属离子柱纯化后镍柱的总蛋白收获率最高,铜柱与锌柱居中,钙柱最低;而柱保留时间则为锌柱最高(12.38 m in),钙柱最低(8.25 m in);钙柱洗脱时所需咪唑解离初始浓度最低(100 mmol/L),锌柱最高(200 mmol/L);对SDS-PAGE电泳图进行分析得纯化后类人胶原蛋白的纯度分别为:镍柱82.8%,铜柱83.4%,锌柱96.2%,钙柱94.3%。由此可见锌柱对目标蛋白的亲和力最高,且纯化后类人胶原蛋白的纯度也最高。因此,确定锌离子作为亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的金属离子。     

免疫亲和层析净化高效液相色谱测定赭曲霉毒素A的方法研究

试样经甲醇-水或碳酸氢钠-水溶液提取,提取液稀释过滤后经过含有赭曲霉毒A特异性抗体的免疫亲和柱层析净化,洗脱液用C18(150×4.60mm,5μm)色谱柱分离,荧光检测器测定。流动相为乙腈:水:乙酸为99:99:2;激发波长333nm;发射波长477nm;柱温35℃;进样量100μl;外标法定量,结果表明,色谱峰面积与含量之间有良好的线性关系,方法的检出限为0.2μg/kg,加标回收率为90.3%～106%,对不同浓度的样品相对标准偏差RSD为1.75%～4.32%。该方法操作简便、准确,回收率高、精密度良好、重现性好,可用于谷物、酒类、调味料等产品中赭曲霉毒素A的测定。     

人骨肉瘤OS-732单克隆抗体的制备及纯化

目的制备、纯化抗人骨肉瘤OS-732单克隆抗体。方法通过杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,ProteinA-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单抗,SDS-PAGE、免疫组化及ELISA检测该单抗的性质。结果SDS-PAGE鉴定单抗纯度达到93%,ELISA检测抗体免疫活性效价为1×10-7。结论制备、纯化了具有较高纯度及生物活性的的抗骨肉瘤OS-732单克隆抗体,为下一步骨肉瘤靶向治疗打下了基础。     

人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备

目的：构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法：将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进-步真空冷冻于燥,制备YB...     

凝血酶的亲和层析纯化技术

以新鲜猪血为原料 ,采用离心、激活、沉淀等技术提取出粗凝血酶 ,利用化学方法将分子量范围在 6KD左右的肝素连接到经溴化氰活化的 Sepharose CL- 6B树脂上 ,制成亲和树脂 ;采用亲和方法 ,从粗酶中纯化得到猪凝血酶。活性测定表明 ,在保持酶的底物专一性的同时 ,凝血酶的比活上升了 32 .5倍左右。计算总活力回收率约 5 0 .6%。同时对肝素亲和层析柱的制备以及洗脱方法进行了探讨。     

玉米SOD的纯化与化学修饰

本文利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤初步分离了玉米SOD,利用金属螯合亲和层析纯化了SOD。比活为8597,纯化倍数为307,回收率为29.4%,电泳后活性染色与蛋白染色均得到3个条带,达到了电泳纯。针对SOD稳定性较差的缺陷,进行了PEG修饰SOD研究。修饰率46%,SOD活性保持度为81%。修饰后的玉米SOD的温度稳定性、pH稳定性均明显提高,与天然SOD相比,PEG-SOD的胰蛋白酶酶切耐受性明显增强。结果表明,PEG修饰玉米SOD是可行的,PEG是一种较好的SOD化学修饰剂。     

免疫亲和层析及其在真菌毒素检测中应用

该文简介免疫亲和层析工作原理,载体要求与选择,免疫亲和柱制备与使用,重点综述免疫亲和层析在黄曲霉毒素,赭曲霉毒素,玉米赤霉烯酮,脱氧雪腐镰刀菌烯醇,伏马毒素,T-2毒素等真菌毒素检测中应用最新进展。     

巴戟天多糖亲和柱层析纯化的研究

通过静态吸附的方法探讨了巴戟天粗多糖在Con A Sephorose4B亲和填料上静态吸附和脱附情况。结果表明,吸附过程中的pH值和离子强度对平衡吸附量有明显影响,得到的最佳吸附条件是pH7.5,NaCl浓度0.1mol/L;确定的最佳脱附条件为是pH6.5,α-D-甲基葡萄糖苷浓度0.02mol/L。由Langmuir方程对实验数据进行拟合,得到填料的最大吸附量qm为9.58mg/g,表观解离常数Kd为3.43mg/g,巴戟天粗多糖在填料上的吸附速率K为0.144mg/h。在最佳的吸附和洗脱条件下,巴戟天粗多糖被分为MOP-A1和MOP-A2两个组分。     

三聚氰胺多克隆抗体的制备、分离纯化及ELISA方法的测试研究

目的:制备具有高特异性的三聚氰胺多克隆抗体,建立三聚氰胺快速检测方法.方法:通过抗原偶联嫁接技术,将不具备免疫原性的三聚氰胺与特定蛋白连接,制备免疫抗原(MB1st、MB2st、KM和ML2).对家兔进行皮下多点注射,初次免疫后取抗体血清,用SDS-PAGE检测血清中IgG的产生情况.采用酶联免疫吸附法测定各抗体血清的效价,最终以亲和层析法纯化血清,获得高特异性的抗体.将纯化后的抗体包被于酶标板上,建立三聚氰胺ELISA方法,并验证其有效性.结果:通过SDS-PAGE证明免疫前、后血清中IgG显著增长.进一步使用间接ELISA法测得各兔血清效价.MB1st免疫的效果最佳,其抗体血清对三聚氰胺的竞争率由纯化前的36.97％上升至纯化后的75.57％.MB2st免疫的抗体血清对三聚氰胺的竞争率由纯化前的30.80％上升至纯化后92.43％.KM免疫的抗体血清效价较低,其对三聚氰胺的竞争率由纯化前的11.95％上升至纯化后的96.09％.ML2免疫效价低,且其抗体血清在纯化前、后均对三聚氰胺没有显著的竞争性.由此建立ELISA方法,并初步验证了该方法的有效性.结论:本试验中制备的三聚氰胺抗体血清.经分离、纯化后得到对三聚氰胺具有较高竞争性的多克隆抗体,为建立酶联免疫方法,以检测食品中三聚氰胺含量提供了理论基础.     

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。