琼脂糖-Zn（II）亲和层析分离纯化罗非鱼水解多肽初探

以广州大学生化课题组自制琼脂糖微球为载体、环氧氯丙烷(ECH)为活化剂、亚氨基二乙酸(IDA)为螯合配基、Zn(Ⅱ)为螯合金属制备琼脂糖-Zn(Ⅱ)亲和层析介质。最佳活化工艺:DMSO 6 mL、ECH 10 mL、活化温度35℃、活化时间3.0 h;最佳螯合工艺:IDA 0.9 g、反应时间4.0 h、ZnSO_4浓度0.25 mol/L,Zn~(2+)螯合量达到最大值。通过用0.05 mol/L EDTA缓冲液洗脱,有效地分离纯化罗非鱼水解多肽,得到适合与Zn(Ⅱ)螯合的目标多肽组分,并制备出多肽-Zn(Ⅱ)配合物。     

应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较

目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35~73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。     

断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用

应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg×m L^-1,动态吸附载量约为30 mg×m L^-1;纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。     

肝素-琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用

以自制琼脂糖凝胶6FF为基质，肝素为配基，利用还原胺化方法制备了肝素-琼脂糖凝胶6FF介质. 考察了肝素偶联反应的影响因素，并对其进行了优化，得到肝素配基的含量为2.7 mg/mL. 用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶III，从血浆开始计算的抗凝血酶III活性回收率为31.76%，与商品Heparin-Sepharose CL-6B的分离效果相当.     

重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺的优化

目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。     

固定化金属离子亲和层析研究进展

固定化金属离子亲和层析(IMAC)作为一种新的亲和层析技术在药物,尤其是生物药物制备上已得到越来越广泛的应用。文章综述了固定化金属离子亲和层析的基本原理、构成及应用现状,对其应用的前景进行了展望。     

截断型人可溶性CD40L的表达与纯化

目的　表达相对分子质量 180 0 0的截断型人可溶性CD4 0L。方法　针对人CD4 0L(Glu10 8 Leu2 6 1)设计引物 ,以全长人CD4 0L为模板 ,扩增目的基因 ,经pGEM T中间载体进一步连接到pQE 4 0载体 ,构建pQE sCD4 0L表达载体。转化E .coliM15后经IPTG诱导表达 ,分离、洗涤包涵体 ,并利用Ni NTA亲和层析纯化目的蛋白 ,经复性后检测对骨髓瘤细胞SP2 0细胞株的抑制作用。结果　克隆的目的基因为 4 80bp ,经测序与文献报道一致 ,所构建的菌株 (M15 pQE sCD4 0L)经诱导表达目的蛋白量为 2 6 7% ,相对分子质量为 180 0 0 ,纯化后蛋白纯度为96 5 % ,对SP2 0细胞有生长抑制作用。结论　原核表达的截断型人可溶性CD4 0L具有抑制肿瘤细胞生长作用。     

亲和层析介质非特异性吸附的定量表征研究

针对亲和层析介质的非特异性吸附,基于脉冲响应法,建立了定量表征方法。以牛血清白蛋白、酵母发酵液和CHO细胞培养液作为典型杂质,考察了四种蛋白A亲和层析介质和两种基质微球,在不同pH和盐浓度条件下非特异性吸附。发现介质和基质对杂质均有不同程度的吸附,在酸性条件下非特异性吸附相对较强。对于不同料液,存在不同的杂质吸附机制,可通过静电、疏水作用或两者共同作用结合。两种介质和基质的比较结果表明,琼脂糖基介质的非特异性吸附主要依赖其基质微球与杂质间相互作用,而聚甲基丙烯酸酯基介质对杂质的吸附作用强于其基质微球。结果表明,本文建立的非特异性吸附定量表征方法切实可行,可用于量化表征介质非特异性吸附,探究相关作用机制,为介质研发提供新的分析方法和依据。     

亲和层析法分离纯化纳豆激酶

目的：以纳豆激酶的作用底物纤维蛋白为配基制备亲和层析胶,分离纯化纳豆激酶。方法：纳豆杆菌发酵液经硫酸铵分段盐析、透析得粗酶,在4℃条件亲和层析法分离纯化,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对酶纯度进行检验。结果：经亲和层析得纳豆激酶为电泳纯,纯化倍数为8.3,回收率43.9%。纯酶的最适pH值和温度分别为pH7.0～9.0、50℃;温度高于60℃纤溶酶活性迅速下降;在pH6.0～10.0范围内稳定性好;Mg2＋对其有微弱激活作用,Cu2+有显著抑制作用。结论：以琼脂糖包埋纤维蛋白制备的层析胶可用于纳豆激酶的快速分离纯化。     

固定化金属亲和层析富集麦胚蛋白金属螯合肽的研究

利用3种蛋白酶(碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、风味蛋白酶Flavourzyme 500MG和木瓜蛋白酶Papain)分别对麦胚蛋白进行酶解,筛选金属螯合率最高的酶解产物,再利用固定化金属亲和层析富集金属螯合肽,并分析金属螯合肽的相对分子质量分布和氨基酸组成。结果表明:在Alcalase 2.4L的酶解作用下,酶解时间200 min时,酶解产物的金属螯合率达到最大值(69.62±0.96)%。以此麦胚蛋白酶解物通过固定化金属离子亲和层析富集得到的组分,相对分子质量集中在180~2 000,谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量分别高达(22.64±1.50)%和(14.93±0.24)%。