一种胰蛋白酶亲和材料的制备及应用

基于抑制剂与酶的特异亲和作用,将具有良好稳定性的荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)固定化,制备成一种胰蛋白酶的亲和吸附剂,实现胰蛋白酶的高效纯化。通过原核表达、Ni2+-NTA亲和层析和Superdex G-25凝胶过滤技术得到电泳纯的BTI,以溴化氰活化琼脂糖凝胶(CNBr-Sepharose CL-4B)作为亲和层析载体,制备亲和吸附剂BTI-Sepharose,检测其对胰蛋白酶的特异性吸附作用,并进一步研究BTI-Sepharose对胰蛋白酶吸附及解吸附的条件。制备的BTI-Sepharose对胰蛋白酶具有特异吸附性,可用于胰蛋白酶的亲和纯化。缓冲液p H对BTI-Sepharose与胰蛋白酶的吸附及解吸附均有重要影响,二者吸附作用的最适pH为7.2,在pH为3.5时两者能够完全分离,且不影响胰蛋白酶的生物活性。试验制备的BTI-Sepharose可实现一步层析制备高纯度胰蛋白酶,为胰蛋白酶的高效纯化及新型胰蛋白酶的研究开发提供理论依据。     

亲和层析快速提取白果和大豆的抗氧化蛋白

用环氧氯丙烷活化法把血红素结合于惰性分子筛填料SephadexG-25上作为配基做成亲和层析柱,用于从白果或大豆中提取具有抗氧化活性的蛋白。此层析柱以去离子水为平衡液、0.2mol/L的NaAc-HAc缓冲液（pH3.6）为洗脱液,层析得到的蛋白经亚油酸-硫氰酸钾抗氧化活性测定证明具有较高的抗氧化活性。白果全蛋白的抗氧化活性为7.92%,经此方法提纯后得到2种抗氧化多肽,活性达到17.45%;而大豆中的抗氧化蛋白经纯化则得到多种,抗氧化活性由全蛋白时的10.52%提高至30.72%。这是一个新的、只需一个步骤即可从白果或大豆蛋白提取液中提取到具有高抗氧化活性蛋白的方法,具有成本低,快速高效的特点。      

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测小麦中玉米赤霉烯酮

用50 ml乙腈-水(体积比90:10)萃取小麦试样,提取液稀释过滤后经含有玉米赤霉烯酮特异性抗体的Zearala Test免疫亲和柱层析净化,甲醇1.5 ml洗脱,洗脱液用C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分离,流动相为乙腈-水(体积比60∶40)混合溶液,流速为1.0 ml/min,采用荧光检测小麦中玉米赤霉烯酮.试验结果表明,玉米赤霉烯酮质量浓度在10.0～500.0 μg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,方法的检出限(3S/N)为5.0 μg/L.应用此方法分析小麦加标样品,试样的平均回收率为83.7％～86.5％,测定值的相对标准偏差均小于5.0％,符合小麦中玉米赤霉烯酮的检测要求.     

基于免疫亲和层析和ProteoMiner处理的母乳乳清蛋白质组学分析

在去除母乳中高丰度蛋白的基础上,运用蛋白质组学技术分析母乳中具有重要生物学特定功能的低丰度蛋白。以1月左右的成熟乳为实验材料,先通过免疫亲和层析和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒2种前处理方法去除高丰度蛋白,再进行蛋白质组学分析。结果表明,2种方法都有去除高丰度蛋白的效果,免疫亲和层析法处理后鉴定出蛋白质49种,Proteo Miner低丰度蛋白富集试剂盒处理后鉴定出蛋白质172种。对合计鉴定出的186种蛋白进行生物信息学分析,Gene Ontology(GO)注释分析发现,这些蛋白质功能主要集中在细胞部分、细胞过程和结合活性等方面。以Pathway数据库作为参考,依据代谢途径可将蛋白质定位到201个代谢途径分支,涉及PI3K-Akt信号通路、磷脂酶D信号通路等。与Cluster of Orthologous Groups of proteins(COG)数据库进行比对表明,这些蛋白质主要参与碳水化合物的运输和新陈代谢、信号转导机制等生命活动。研究结果不仅有助于了解母乳低丰度蛋白的功能,而且可为婴幼儿的健康成长和疾病预防提供理论依据,为母乳喂养的保护作用机制及有关乳腺疾病研究...     

辣椒及辣椒提取物中黄曲霉毒素含量的测定及迁移规律分析

利用免疫亲和层析净化高效液相色谱法对印度辣椒和新疆辣椒及其辣椒提取物中的黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）进行检测及迁移规律分析。结果表明,不同来源的辣椒和辣椒提取物中存在不同程度的黄曲霉毒素B1（0.93～51.53 μg/kg）污染,在辣椒生产过程中,黄曲霉毒素部分迁移到辣椒油树脂当中,辣椒红中几乎没有。这一结果说明生产过程中黄曲霉毒素污染主要来源于辣椒原料且易迁移到辣椒油树脂中。在生产中要控制产品中黄曲霉毒素的污染,首要的是做到控制好原料。     

菜籽源锌螯合肽的制备、纯化和结构解析

采用碱性蛋白酶水解菜籽蛋白制备水解物,运用固定金属亲和层析(IMAC-Zn2+)和葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)层析分离纯化;利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定序列;采用EDTA络合滴定法(ECT)、双硫腙比色法(DCM)、原子吸收光谱(AAS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)检测锌螯合率。试验表明:菜籽蛋白的4 h水解物锌螯合潜力最佳;分离该水解物获得3个肽组分(I,Ⅱ和Ⅲ),其中Ⅱ和Ⅲ具有锌螯合能力;进一步分离后分别获得3个(Ⅱ-1,Ⅱ-2,Ⅱ-3)和2个肽组分(Ⅲ-1和Ⅲ-2),组分Ⅱ-3的锌螯合率最高,高于同浓度的谷胱甘肽(GSH)(P0.05);鉴定Ⅱ-3序列获得4条肽,即Ala-Arg(AR),Asn-Ser-Met(NSM),Gly-Lys-Arg(GKR)和Glu-Pro-SerHis(EPSH)。其中NSM的锌螯合率最高,来源于菜籽蛋白NADH-enoyl-ACP reductase Chain A序列中的296-298氨基酸残基。因此,菜籽蛋白可以作为微量元素螯合肽的优良来源。     

琼脂糖凝胶提取纯化抑肽酶的研究

采用琼脂糖凝胶为载体,共价偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,将其用于亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶。通过实验研究,计算抑肽酶抑制比活单位(BAEE单位/mg胰蛋白酶)为79000,酶活性回收率76.63%。该工艺具有操作简便、收率高、产品质量好、污染低等优点,适于工业化,有一定的工业应用前景。     

咸鸭蛋清抗生物素蛋白的分离纯化及快速测定方法的建立

采用2-亚氨基生物素琼脂糖凝胶4B从酸热变性后咸鸭蛋清中亲和分离了抗生物素蛋白,并利用生物素化的过氧化物酶偶联起显色反应,建立了一种简便的抗生物素蛋白含量测定新方法．进而对咸鸭蛋清抗生物素蛋白进行了普查。实验结果表明：咸鸭蛋清抗生物索蛋白回收率达60．1％±5．0％,纯化倍数为222．5,纯化蛋白经SDS—PAGE电泳均显示单一蛋白染色带,其对应的分子量约为67．8K,咸鸭蛋清抗生物素蛋白质量分数约为0．05％,是抗生物索蛋白潜在的资源,本研究为咸鸭蛋清的回收利用打下了基础。     

人α_1型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制

应用杂交瘤技术建立了稳定分泌抗rHu-IFN-α_1的单克隆抗体细胞系,体外连续传代8个月以上,在BALB/c鼠体内连续传代6个月以上,分泌抗体能力不变,特异性专一。11D_2单抗为IgG_2b,17D_9单抗为IgG_1。采用不同方法提纯抗体均得到90％纯度。11D_2单抗中和效价为1024,17D_9单抗为65534。制备亲和层析柱的最佳抗体浓度为5mg/ml,凝胶与抗体体积比为1:2,偶联率均达到95％～98％。11D_2单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1干扰素不易被洗脱,不适宜制备亲和层析柱。17D_9单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1结合的抗原容易被洗脱,适宜制备亲和层析柱。粗制rHu-IFN-α_1经17D_9单抗层析柱后,获得了电泳纯级制品,比原纯度增加15倍,平均收率93％,比活性平均值为6.5×10~6IU/mg。残余鼠IgG量符合规程要求。     

肝素-壳聚糖亲和层析纯化猪凝血酶研究

采用反相悬浮交联法制备壳聚糖球珠,壳聚糖球珠经过环氧氯丙烷活化并与肝素耦联制成亲和层析剂分离和纯化猪凝血酶。结果表明制备出几何形态、分散性、溶胀性均良好的壳聚糖球珠的最佳条件是:5%壳聚糖溶液112.5mL、液体石蜡75mL、乙酸乙酯15mL、甲醛10mL、戊二醛2mL、Span808滴、转速2500r/min。壳聚糖球珠用ddH2O溶胀24h,具有明显的多孔性。猪凝血酶活性检测结果表明肝素-壳聚糖亲和层析剂能够用于猪凝血酶的分离和纯化。此研究结果对于亲和层析剂的制备和猪凝血酶的分离和纯化具有一定的参考价值。