扇贝土和黄土在刺参幼参饲料中的应用研究

为探寻刺参Apostichopus japonicus饲料中品质优、资源广、价格廉的海泥替代物,用扇贝土和混合一定比例螺旋藻(1∶9)的黄土分别替代海泥,并搭配海带投喂平均体质量为0.35 g的刺参幼参,试验设海泥组、扇贝土组、黄土组,每组设3个重复,在室内水族玻璃缸中进行试验,每个缸中放80头幼参,饲养时间为56 d,养殖试验结束后,分别测定各组刺参的生长、消化和非特异性免疫指标。结果表明:扇贝土组和黄土组刺参的成活率、增重率、特定生长率、蛋白质效率等均高于海泥组,而饲料系数略低于海泥组,但均无显著性差异(P>0.05);黄土组脏壁比、比肠重显著低于扇贝土组和海泥组(P<0.05);扇贝土组刺参肠道中淀粉酶活力显著高于黄土组(P<0.05),但两组与海泥组均无显著性差异(P>0.05);扇贝土组刺参体腔液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力显著高于黄土组(P<0.05),且两组显著高于海泥组(P<0.05);扇贝土组和黄土组刺参体腔液过氧化物酶(POD)活力及总抗氧化能力(T-AOC)高于海泥组,但无显著性差异(P>0.05)。研究表明,扇贝土和混合螺旋藻的黄土均可作为新资源完全替代海泥饲料,且以扇贝土最优。     

几种微生态制剂对刺参幼参生长、存活和消化酶活性的影响

以体质量(2.00±0.52)g的刺参Apostichopus japonicus幼参为研究对象,定期将光合细菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、海洋红酵母4种微生态制剂及其四者的复合微生态制剂(按照终浓度比为4∶1∶4∶1的比例)添加到刺参幼参培育水体中,探讨其对刺参幼参生长、存活率和消化酶活性的影响。结果表明:养殖水体中添加不同的微生态制剂对刺参幼参的生长和存活有一定的促进作用,其中增重率和特定生长率最高出现在复合微生态制剂组,分别达到(125.97±8.26)%和(1.66±0.06)%/d,与对照组有显著性差异(P<0.05);添加微生态制剂能够显著提高刺参幼参的消化酶活性,尤其是添加将4种菌剂按适当比例复合的微生态制剂后,刺参幼参的消化酶活性与其他微生态制剂组相比有显著性差异(P<0.05)。研究表明,将4种有益菌按照一定比例复合后投放到幼参培育水体中相对于单个菌投放更能显著提高幼参消化酶的活性。     

刺参速生耐高温品系生长性能及高温期摄食性能分析

为分析定向选育刺参Apostichopus japonicus速生耐高温品系的生长性能和高温期摄食性能,对该品系刺参第四世代(G4)、第三世代(G3)及未经选育的普通刺参(对照)4—30月龄的生长指标进行连续和定期测定,并对26～30月龄刺参高温期排粪个体数量比例及粪便相对质量(RFM)进行测定和分析。结果表明:3组刺参体质量增长分化时间点出现在13～14月龄时期,G4、G3两组刺参的体质量峰值和终末值均显著高于对照组(P<0.05),G4组体质量峰值和终末值高于G3组,但无显著性差异(P>0.05);在2016年6—10月(14～18月龄)和2017年4—8月(24～28月龄)两个高温时期内,G4与G3两组刺参的增重率(WGR)均显著高于对照组(P<0.05),但G4与G3组无显著性差异(P>0.05);排粪个体数量比例和RFM均随水温升高显著降低(P<0.05),同温度下G4>G3>对照;排粪个体数量比例仅在水温上升期升至26.4℃和水温下降期降至23.8℃时差异显著(P<0.05);RFM在各取样水温下均呈显著性差异(P<0.05);当RFM取值为0.001～0.020,G4、G3组对应水温值比对照组高出0.30～2.48℃,RFM取值为0.010时,G4、G3组水温分别为26.39、26.09℃,对照组水温为23.91℃,表明水温因素限制选育品系刺参摄食活动的影响有所降低。研究表明,经累代定向选育的速生耐高温刺参品系比普通刺参生长增重更快,高温期摄食性能更具优势。     

低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况。结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大。研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关。     

3种养殖方式下刺参营养成分和功能成分的研究

对大连地区圈养、浅海和深海3种养殖方式下平均体质量分别为67.11、96.15、258.40 g刺参Apostichopus japonicus的营养成分(灰分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸)、功能成分(多糖、胶原蛋白)进行比较分析。结果表明:圈养刺参的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量最高,灰分含量最低;圈养刺参的多糖含量最高,且含有较高的氨基糖和糖醛酸,而深海刺参的胶原蛋白含量最高;3种养殖方式下,刺参的脂肪酸含量均以多不饱和脂肪酸为主,其中,深海刺参所含的多不饱和脂肪酸最高,尤其是EPA;3种养殖方式下,刺参的谷氨酸含量均最多,圈养刺参的必需氨基酸含量最高。研究表明,不同养殖方式下,刺参的营养成分和功能成分有明显差异,本研究结果可为生产者加工和消费者购买刺参提供参考。     

刺参多功能表皮生长因子6(megf6)cDNA克隆及在肠再生过程中的表达分析

为了探究刺参Apostichopus japonicus多功能表皮生长因子6(multiple epidermal growth factor 6)的生物学信息和功能,利用RACE技术克隆了体质量为(92.0±4.0)g的成体刺参megf6基因(Aj-megf6)cDNA全长序列,并分析了该基因的信息学特征及其在肠再生过程中表达水平的变化。结果表明:刺参megf6基因的cDNA序列全长为5665 bp,共编码了1604个氨基酸,具有37个EGF样结构域;该基因编码蛋白的相对分子质量为172 500,理论等电点为4.74,该蛋白具有信号肽,为分泌蛋白,属于亲水性、非跨膜蛋白,共有53个磷酸化位点,分别为23个Ser位点、12个Thr位点、18个Tyr位点;MEGF6氨基酸多序列比对发现,刺参MEGF6与其他物种的氨基酸序列一致性为38.59%～49.07%,其中与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus的一致性最高,为49.07%,其次为长棘海星Acanthaster planci(48.71%);基于MEGF6氨基酸序列的系统进化树分析显示,刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支,该结果符合刺参的分类和进化地位,MEGF家族成员间比对分析显示,MEGF家族成员间具有一定的分化;实时定量PCR (qPCR)结果显示,在刺参肠再生过程中megf6 mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,其中再生6 d时的表达量达到峰值,为对照组的126.47倍,再生18 d时降至正常水平。研究表明,刺参megf6基因的表达与刺参肠管形态的变化趋势相一致,推断megf6可能在刺参肠再生过程中发挥重要作用。     

海洋红酵母H26对刺参幼参生长、免疫指标和肠道菌群的影响

为探讨在饲料中添加海洋红酵母Rhodotorula sp.H26对刺参Apostichopus japonicas幼参生长、免疫指标和肠道菌群的影响,以体质量为(0.54±0.06)g幼参为试验对象,研究了饲喂基础饲料(对照组)和含H26为10⁵、105、10⁷cells/g的饲料后,幼参生长、消化酶活力、体壁营养和脂肪酸组成,以及免疫指标和肠道菌群的变化。结果表明:在试验第4周时,饲喂含H26为107cells/g的饲料后,幼参生长、消化酶活力、体壁营养和脂肪酸组成,以及免疫指标和肠道菌群的变化。结果表明:在试验第4周时,饲喂含H26为10⁷cells/g饲料幼参特定生长率较对照组显著提高(P<0.05);在试验第4周和第8周时,饲喂含H26为107cells/g饲料幼参特定生长率较对照组显著提高(P<0.05);在试验第4周和第8周时,饲喂含H26为10⁵、105、10⁷cells/g饲料的幼参肠道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均显著增加(P<0.05);在试验第4周和第8周时,饲喂含H26为107cells/g饲料的幼参肠道胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均显著增加(P<0.05);在试验第4周和第8周时,饲喂含H26为10⁵和/或105和/或10⁷cells/g饲料的幼参具有较高的体壁粗蛋白质和糖分含量;在第8周时,饲喂含H26为107cells/g饲料的幼参具有较高的体壁粗蛋白质和糖分含量;在第8周时,饲喂含H26为10⁷cells/g饲料的幼参具有较低的体壁灰分含量;在试验第8周时,饲喂含H26为107cells/g饲料的幼参具有较低的体壁灰分含量;在试验第8周时,饲喂含H26为10⁵cells/g饲料的幼参体壁花生四烯酸(C_(20:4n-6))/二十四烯酸(C_(24:1))含量显著高于/低于饲喂基础饲料幼参(P<0.05),饲喂含H26为105cells/g饲料的幼参体壁花生四烯酸(C_(20:4n-6))/二十四烯酸(C_(24:1))含量显著高于/低于饲喂基础饲料幼参(P<0.05),饲喂含H26为10⁷cells/g饲料的幼参比对照组具有较高/较低的体壁C_(20:4n-6)、二高-γ-亚麻酸(C_(20:3n-6))、肾上腺酸(C_(22:4n-6))/油酸(C_(18:1))、亚油酸(C_(18:2n-6))、二十碳二烯酸(C_( 20:2n-6))+二十碳三烯酸(C_(20:3n-6))和二十碳五烯酸(C_(20:5n-3))含量;试验第4周和/或第8周时,与对照组比较,饲喂含H26为107cells/g饲料的幼参比对照组具有较高/较低的体壁C_(20:4n-6)、二高-γ-亚麻酸(C_(20:3n-6))、肾上腺酸(C_(22:4n-6))/油酸(C_(18:1))、亚油酸(C_(18:2n-6))、二十碳二烯酸(C_( 20:2n-6))+二十碳三烯酸(C_(20:3n-6))和二十碳五烯酸(C_(20:5n-3))含量;试验第4周和/或第8周时,与对照组比较,饲喂含H26为10⁵、105、10⁷cells/g饲料的幼参体腔细胞呼吸爆发、体腔细胞裂解液上清液(CLS)溶菌酶活力及体腔液上清液(CF)和CLS酚氧化酶活力显著增加(P<0.05),饲喂含H26为107cells/g饲料的幼参体腔细胞呼吸爆发、体腔细胞裂解液上清液(CLS)溶菌酶活力及体腔液上清液(CF)和CLS酚氧化酶活力显著增加(P<0.05),饲喂含H26为10⁷cells/g饲料的幼参体腔细胞吞噬活力及CF溶菌酶活力显著提高(P<0.05);变性梯度凝胶电泳图谱显示,H26对肠道菌群无显著影响(P>0.05)。研究表明,饲料中添加H26,可促进幼参生长、增强消化酶活性、增加营养价值,并刺激幼参先天免疫系统。     

刺参C型凝集素(AJL)基因的克隆及原核表达分析

为了开发海参免疫基因,生产重组免疫因子蛋白,利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)获得了刺参凝集素基因(Apostichopus japonicus Lectin,AJL)的编码区序列(Coding sequence,CDS),CDS的长度为492 bp,编码163个氨基酸,其中成熟肽由143个氨基酸组成。将成熟肽的基因克隆并连接至载体p ET-32a(+)中,成功构建了原核表达的重组体p ET-32a(+)-AJL,进一步将重组体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经诱导表达、分离纯化,获得了融合表达蛋白。本研究结果为进一步研究重组刺参C型凝集素在刺参健康养殖上的应用奠定了基础。     

刺参养殖池塘围隔环境特征及生态育苗的初步研究

为探索高效安全的刺参生态苗种培育途径,在刺参Apostichopus japonicus养殖池塘运用陆基围隔法比较了池塘围隔内外的环境特征(2010年10月至2011年11月),并采用搅底、施用微生态制剂、培养底栖硅藻和换水等技术方法,对刺参幼虫、稚参进行了生态育苗试验(2011年6—11月)。结果表明:试验池塘的水温与盐度呈负相关,温幅和盐幅较大却变化缓慢,pH稳定于7.9⁸.2,COD含量小于10 mg/L,透明度较高,营养盐含量低;浮游生物小型化明显,浮游植物以硅藻占优势,浮游动物以桡足类占优势;围隔内刺参幼虫由小耳期发育到中耳期,成活率为50%,发育到大耳期,成活率为25%;稚参转入围隔48 h后的成活率为20.0%,70 d后的成活率为2.2%,每个围隔内稚参的平均质量从5 g/m3增加到37.9 g/m3。研究表明,在刺参养殖池塘中设置围隔,对幼虫和稚参进行生态育苗是可行的。     

仿刺参3个地理群体ITS1序列变异及系统发生分析

利用核糖体DNA第一内转录间隔区(Internal transcribed spacer 1,ITS1)序列,对中国大连(CD)、朝鲜罗津(KN)和俄罗斯海参崴(RV)仿刺参Apostichopus japonicus 3个群体的遗传结构进行分析。结果表明:经PCR扩增、克隆测序,获得长度为517⁵19 bp、524 bp两种类型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5%)显著高于A+T含量(35.5%);在仿刺参30个个体61条序列中共检测到49个变异位点,多态位点比例为9.33%,其中有4个简约信息位点,共有40种基因型,群体共享基因型为2个;遗传多样性分析表明,3个群体的遗传多样性丰富;分子方差分析显示,88.65%的变异来自于群体内部,群体间遗传分化较弱或中度分化;根据群体间遗传距离进行的聚类分析发现,KN群体与RV群体的亲缘关系较近,CD群体与KN、RV群体的亲缘关系较远。