抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用

目的制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量。方法用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAV IgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性。以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78%;效价最高为1∶16 000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25⁷0℃条件下处理15 min及经pH 3.070℃条件下处理15 min及经pH 3.0¹0.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.6210.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62² 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,最低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7。结论制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量。     

奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

采用饱和硫酸铵盐析和Sephadex G-200柱层析方法制备奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus(体质量为500～1 000 g)免疫球蛋白(IgM),以其为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,免疫3～4次后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法对杂交瘤进行筛选。结果表明:阳性克隆经3次亚克隆后,共获得6株针对罗非鱼IgM的单克隆抗体(mAb),分别命名为1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3,所有单抗均为IgG类,各株杂交瘤的细胞上清ELISA效价为1∶800～1∶3 200;制备4B3和1G11的腹水单抗,ELISA效价分别为1∶102 400和1∶6 400。免疫印迹试验结果表明,mAb 4B3能在变性条件下识别罗非鱼IgM的重链,约在相对分子质量85 000左右。用ELISA检测4B3对罗非鱼IgM的敏感性,IgM灵敏度为10μg/L。利用所制备的单抗4B3建立了评价无乳链球菌Streptococcus agalactiae灭活疫苗免疫罗非鱼血清抗体水平的三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)方法,结果表明:腹腔注射和浸泡免疫无乳链球菌灭活疫苗14 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗无乳链球菌的抗体比对照组稍有增加;免疫21 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗体均有明显增加;免疫35 d后增加更为显著,达到最高峰,注射组效价达1∶2 560,浸泡组达1∶640;免疫56 d后抗体开始下降,直到第98天还维持在明显高于对照组的抗体水平。本研究表明,所制备的罗非鱼IgM mAb可用于评价罗非鱼疫苗免疫效果及抗体产生规律等,具有广阔的应用前景。     

人类冷冻精子经卵黄缓冲液冷处理后的受精率变化

本研究应用人精子－去透明带地鼠卵穿透试验（SPA），探讨了人类冷冻精子经卵黄缓冲液4℃冷处理后的受精率改变。结果表明，卵黄液对冷冻精子SAP受精率有改善的效应，但这种效应存在明显的标本差异。     

同时注射乙肝高效免疫球蛋白和卡介苗对新生儿接种卡介苗效果影响研究

目的:探讨同时注射乙肝高效免疫球蛋白(HBIG)和卡介苗对新生儿接种卡介苗效果的影响。方法:选取连州市妇幼保健院Hbs Ag(+)孕产妇及其新生儿作为观察组(100例),同期选取Hbs Ag(-)孕产妇及其新生儿作为对照组(96例),观察组新生儿出生后12 h内同时注射HBIG,接种乙肝疫苗与卡介苗,对照组新生儿新生儿出生后12 h接种乙肝疫苗与卡介苗,比较两组新生儿乙肝感染率、乙肝母婴传播有效阻断率、首次接种卡介苗成功率、红肿浸润时间、脓肿形成时间、结疤时间及卡疤大小。结果:两组新生儿乙肝感染率及乙肝母婴传播有效阻断率比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组首次接种卡介苗成功率、卡疤黄豆大比例明显高于对照组,新生儿红肿浸润形成率、脓肿形成率明显低于对照组,红肿浸润时间与脓肿形成时间明显长于对照组,结疤时间明显短于对照组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:新生儿出生后12 h内同时注射HBIG和卡介苗有助于显著改善Hbs Ag(+)母亲娩出新生儿接种卡介苗的效果,值得临床推广应用。     

牛初乳鲜奶的加工工艺研究

以产后1～3d的混合牛乳为原料，离心脱脂后，采用在牛初乳混合样中添加不同剂量的磷酸氢二钠、CMC（羧甲基纤维素）、乳糖的方法，增加牛初乳的热稳定性。在单因素试验的基础上，经过L9（3^3）正交试验确定：磷酸氢二钠、CMC（羧甲基纤维素）、乳糖分别对应的添加量为0．0027、0．0023、0．0027g／ml，最佳杀菌温度为60℃，杀菌时间为20min。经过此方法加工而成的牛初乳鲜奶能保留一定量的免疫球蛋白，可以在一定程度上提高人体的免疫力，不失为一种较好的功能性牛乳饮品。     

聚苯乙烯球珠辐射接枝丙烯酰胺

本工作研究放射免疫检测用的聚苯乙烯球珠辐射接枝丙烯酰胺的情况,並观察经化学处理的球珠(改性球珠)结合免疫球蛋白的能力。实验结果表明,接枝反应在3h内基本完成,接枝温度60℃左右接枝率最大,高剂量率辐照接枝率较低,吸收剂量和单位浓度增加,接枝率也增加,辐照时生成的过氧化物在室温下的分解半衰期约50h。改性球珠结合免疫球蛋白的能力大于原球珠,並随接校率的增加呈现有规律的变化。     

国产静脉注射人免疫球蛋白制品中凝血激活物水平分析

目的分析11家中国血液制品企业共计64批次上市后的静脉注射人免疫球蛋白(immunoglobulin for intravenous injection,IVIG)(p H 4)制品中凝血激活物水平,对国内IVIG制品在促凝血方面的安全性作出评估,为提高制品质量标准提供参考。方法利用非活化的部分凝血活酶时间法(non-activated partial thromboplastin time,NAPTT)、凝固法(一期法)及本实验室建立的改良凝血酶生成试验(modified thrombin generation test,M-TGT),分别测定64批次国产和7批次进口IVIG样品的NAPTT、系列凝血因子活性、活化凝血因子Ⅺ(FⅪa)的含量及凝血酶生成含量达到最高值时所需时间(time to peak,TTP),分析IVIG的凝血激活物水平。结果除国内厂家F所生产的2批IVIG中FⅪ活性为0.030~0.036 IU/ml外,其余国产62批次产品中FⅪ活性均低于试剂最低检测限未检出;所有产品中TTP均大于40 min,FⅪa含量均小于0.37 nmol/L,NAPTT均大于203 s。结论所调查的11家共计64批次的国产IVIG制品的凝血激活物水平均较低。今后在我国是否推行IVIG制品的凝血激活物检测尚需进一步研究。     

巴氏消毒法对乙型肝炎人免疫球蛋白病毒灭活效果的验证

目的以伪狂犬病病毒(PRV)、Sindbis病毒和HIV-1为模型病毒,验证巴氏消毒法对乙型肝炎人免疫球蛋白(HBIG)的病毒灭活效果。方法将模型病毒按1:9(v/v)的比例加入HBIG样品中,60℃水浴保温10h,测定病毒滴度,观察病毒灭活效果,并以放射免疫法测定病毒灭活前后样品抗HBsAg效价的变化。结果病毒灭活后,PRV滴度下降超过5LgCCID50/0.1ml,Sindbis病毒滴度下降超过6LgPFU/ml,HIV-1滴度下降超过4LgCCID50/0.1ml;3批HBIG样品的抗HBsAg效价分别降低了6.5%、6.0%和5.8%。结论巴氏消毒法可以对HBIG样品中的模型病毒进行有效灭活。目的以伪狂犬病病毒(PRV)、Sindbis病毒和HIV-1为模型病毒,验证巴氏消毒法对乙型肝炎人免疫球蛋白(HBIG)的病毒灭活效果。方法将模型病毒按1:9(v/v)的比例加入HBIG样品中,60℃水浴保温10h,测定病毒滴度,观察病毒灭活效果,并以放射免疫法测定病毒灭活前后样品抗HBsAg效价的变化。结果病毒灭活后,PRV滴度下降超过5LgCCID50/0.1ml,Sindbis病毒滴度下降超过6LgPFU/ml,HIV-1滴度下降超过4LgCCID50/0.1ml;3批HBIG样品的抗HBsAg效价分别降低了6.5%、6.0%和5.8%。结论巴氏消毒法可以对HBIG样品中的模型病毒进行有效灭活。     

精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白疏水层析方法的优化

目的对精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白疏水层析方法进行优化。方法将胃蛋白酶直接加入制备好的高效价马抗H5N1禽流感病毒血清进行消化裂解,再加入饱和度为26%的硫酸铵溶液,盐析沉淀离心一次后,直接进行疏水层析进一步纯化F(ab′)2抗体。结果连续洗脱依次出现6个蛋白峰,50min左右,洗脱峰3开始出现,其中含大部分F(ab′)2抗体,此时硫酸铵摩尔浓度约为1.0～1.1mol/L。阶段梯度洗脱,当硫酸铵摩尔浓度降至1.0mol/L时,大量F(ab′)2片段被洗脱下来,纯度达90%以上。结论优化了精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白的疏水层析方法,降低了硫酸铵用量,减少了离心次数,生产周期也大大缩短。