体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M

为建立体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M（Rebaudioside M,RM）,该文分别构建了含有甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1和水稻来源的糖基转移酶EUGT11以及拟南芥来源的蔗糖合成酶SUS1的重组大肠杆菌,将甜菊苷经一锅法催化合成RM。为提升该体系中限速酶EUGT11的酶活,从而提升整个体外多酶级联反应体系的RM产量,本文将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联,并比较一重、二重、三重和四重启动子启动转录时该酶活性,当三重启动子启动转录时,重组酶EUGT11的酶活力最高,是一重启动子启动转录时的2.13倍,在酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39的体外多酶级联反应体系中,RM产量为3.79 mmol/L,较酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3的体外多酶级联反应体系中,RM的产量提升了2.35倍。该文成功建立了高效合成RM的体外多酶级联反应体系,为此后工业化酶法合成RM提供理论和数据支持。     

曲霉属蛋白表达中高效启动子的应用研究

曲霉属丝状真菌,尤其是黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae),常被作为宿主菌表达生产各类蛋白并在工业上得以广泛使用。工业生产中,为了提高蛋白产量,获取更大的经济效益,需要对影响蛋白表达的各种因素进行改进,使用高效的启动子便是其中策略之一,强启动子的使用能够从转录水平上提高同源或是异源蛋白在曲霉中的表达产量。该文介绍了曲霉蛋白表达过程中常见启动子的使用情况,重点阐述了国内外改进启动子活性构建高效启动子的几种策略,对新型启动子在曲霉蛋白表达中的应用做出了展望。      

热带假丝酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子功能鉴定

热带假丝酵母是重要的工业生产菌株,但表达系统还不完善导致代谢工程育种手段受到限制。探索新的表达元件对热带假丝酵母的基因工程育种十分重要。本文通过多重序列比对从热带假丝酵母ATCC 20336基因组中扩增得到一个具有较高活性的磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子,以酵母增强型绿色荧光蛋白(yeGFP3)作为报告基因,整合到热带假丝酵母基因组上并对其表达活性进行研究。通过分离300、550、750 bp和846 bp4个长度的启动子片段分别表达yeGFP3,转化XZX宿主菌获得P-1、P-2、P-3和P-4共4个转化子。荧光显微镜结果表明,随着启动子长度的截短,荧光逐渐减弱,前3个转化子的相对荧光强度分别为P-4的4.98%、9.84%和48.4%。同时分析了4个转化子的yeGFP3转录水平,转录水平分别为P-4的5.6%、13.8%和60%。初步判断PGK1启动子至少存在2个上游激活序列(UAS)。     

生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建

为构建生物转化法生产茶氨酸的基因工程菌，作者分析了影响大肠杆菌高效表达γ-谷氨酰基转肽酶的几个主要因素．将大肠杆菌JM109的ggt基因接入两种不同的质粒中后，转化大肠杆菌JM109，并在一定的条件下进行表达．通过对比E．coli JM109和转化子的γ-谷氨酰基转肽酶表达活性的不同，探讨了ggt基因的拷贝数、启动子的强弱等几个因素对γ-谷氨酰基转肽酶高效表达的影响．实验表明，将含有自身信号肽和启动子的E．coli JM109的ggt基因接入高拷贝的质粒pUC18中，仅提高ggt基因的拷贝数不能增加γ-谷氨酰基转肽酶的表达量．将含有自身信号肽但不含有自身启动子的E．coli JM109的ggt基因接入具有tac启动子的表达载体pEtac中，发现在强启动子tac的控制下，γ-谷氨酰基转肽酶的表达量提高至出发菌株的2．3倍．将构建的工程菌用于生物转化法生成茶氨酸，底物转化率相应地提高至出发菌株的1．7倍．     

重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

STGC3基因启动子生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学预测并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体。方法采用生物信息学软件预测STGC3基因5'端上游调控区5 000 bp序列进行启动子预测与分析,克隆最有可能的启动子,构建萤火虫荧光素酶双报告基因重组质粒,重组质粒经MluⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果 STGC3基因5'端上游-3 046 bp至-46 bp区域内有启动子活性,在-2 992 bp至-69 bp间启动子分值达0.8以上,其中-845 bp至-795 bp间分值最高,达到1.0。在-1 140 bp和-774 bp处检测到GC盒信号;在-441 bp处检测到CAAT盒信号。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp间各有一个Cp G岛;在-2 348 bp和-948 bp处各有一个转录起始位点。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)启动子片段构建p GL3-en283、p GL3-en281及p GL3-en571三种质粒,质粒经酶切测序,酶切片段大小一致,序列正确。结论根据生物物信息学分析结果,成功构建STGC3基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为双荧光素酶报告基因检测系统研究该基因启动子活性提供前期基础。     

乳酸菌中糖诱导的基因表达研究进展

乳酸菌是指一类能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的通称,常用于表达外源蛋白以及作为药物分子的载体。乳酸菌中异源基因的表达通常包含组成型启动子和诱导型启动子,国内外学者研究了许多诱导型的表达系统,包括Nisin诱导、温度诱导、糖诱导等。糖在乳酸菌工业中具有非常重要的作用,同时糖诱导的表达系统具有许多优势,因此国内外对糖诱导的基因表达进行了深入的研究。现主要从糖代谢的机理、糖诱导的基因表达等方面(包括乳糖、木糖、麦芽糖等)对其进行综述,旨在为乳酸菌糖诱导型表达外源蛋白研究提供资料。     

启动子序列的非均衡检测识别算法

通过改进Hessian矩阵对角参数,调整支持向量机中超平面的位移,将数据量少的样本从两类非均衡样本中进行分离,结合隐马尔可夫随机迭代,实验发现,不能简单固定Hessian矩阵的对角参数,而必须加之以可调整的权系数才能控制错分的样本数.对启动子序列进行识别,平均识别率达到92.8%.     

人а干扰素转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人а干扰素(interferon-а,IFN-а)转基因小鼠,为研究IFN-а在抗病毒中的作用提供模型动物.[方法]将人IFN-а基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过原核显微注射法建立IFN-а转基因小鼠.[结果]通过特异性引物PCR法和South-ern杂交法检测出4只阳性转基因小鼠.分离4个转基因鼠系F<,1>代PCR阳性小鼠血液中的淋巴细胞进行RT-PCR检测,其中3个鼠系为阳性.收集阳性小鼠血清,用ELISA方法和微量板染色测定法检测出3个转基因鼠系均有IFN-а表达.[结论]成功建立了CMV启动子启动的表达人IFN-а基因转基因小鼠,为研究干扰素抗病毒机制及对其他动物进行抗病毒感染基因工程育种研究奠定了基础.     

启动子对重组大肠杆菌合成番茄红素能力的影响

为了简化重组大肠杆菌生产番茄红素的工艺,该研究通过选择大肠杆菌中17个转录因子相关基因的启动子序列,以编码番茄红素合成基因的CrtEBI为目的基因,通过构建表达番茄红素合成基因的质粒,来评估转录因子相关基因启动子序列对番茄红素产量的影响。通过比较不同菌株合成番茄红素的能力,确定最佳启动子。结果表明,含有组成型启动子P_lpp或P_mglb的菌株合成番茄红素的能力较强,相较于传统诱导型启动子菌株产量分别提高了347.7%和51.3%。由于筛选到的启动子为组成型启动子,省去了添加诱导剂的过程,达到了优化生产工艺、降低生产成本的目的。