L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。     

不同来源异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)和脱氧木酮糖磷酸合成酶(DXS)对重组大肠杆菌番茄红素产量的影响

为获得更多异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)和脱氧木酮糖磷酸合成酶(1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase,DXS)相关功能基因资源,本研究选取来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粘细菌(Myxococcus stipitatus)、戈壁奇球菌(Deinococcus gobiensis)的4种IDI和DXS,分别克隆到表达载体,将其与含有合成番茄红素基因的pTrc99aEBI质粒共同在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明,来源于粘细菌的IDI和DXS可以获得最高的番茄红素产量,分别达到了10.86、7.94 mg/g DCW。协同表达经过密码子优化的IDI、DXS,番茄红素产量达到了15.26 mg/g DCW。本研究通过比较不同来源的IDI和DXS,获得了新的基因资源。     

茶多酚对肉源腐败菌和致病菌的抑制效果

研究了茶多酚对肉源荧光假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果。设计不同浓度茶多酚溶液(0.0%、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%),采用滤纸片法评判抑制效果。结果表明,茶多酚溶液(0.5%、1.0%、2.0%、2.5%)对荧光假单胞菌有极显著的抑制效果(P<0.01),常用的防腐剂山梨酸钾(1.0%)对其抑制效果却不显著(P>0.05)。茶多酚溶液(1.0%、2.0%、2.5%)和山梨酸钾溶液(1.0%)对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有极显著的抑制效果(P<0.01),茶多酚溶液(0.5%)对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无显著的抑制效果(P>0.05)。通过茶多酚溶液的浓度与4种菌抑菌圈直径的直线相关图可以看出,茶多酚溶液的浓度与鼠伤寒沙门氏菌抑菌圈直径的相关系数最大,荧光假单胞菌次之,其次是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。     

粪肠球菌内源性质粒的序列分析及其穿梭载体的构建

为了对粪肠球菌EXW27的内源性质粒pXW进行DNA序列的测定和分析,并基于其最小复制子构建大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体。本研究从具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27中分离得到了内源性质粒pXW,对其进行了DNA序列的测定及分析,然后利用质粒pXW的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体,并研究大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体的宿主范围、转化效率和稳定性。结果表明该质粒大小为8617 bp,GC含量为33.29%,包含8个ORF,推定为θ型复制质粒。质粒pXW在粪肠球菌EXW27中拷贝数最高可达32.09±0.93,表明质粒pXW属于高拷贝数质粒。本研究确定了质粒pXW的最小复制子,并基于该复制子构建了大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体pXWM1。该穿梭载体具有较宽的宿主范围,可成功转化至不同类型乳酸菌,转化效率介于1.96×102~8.96×104 CFU/μg （质粒DNA）之间,质粒丢失率介于28.54%~54.17%之间。本研究成功构建了一个具有宽宿主范围、高转化效率以及高稳定性的大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体,为乳酸菌基因操作提供了新工具。     

重组E.coli工程菌高密度培养生产人源型胶原蛋白

引　言胶原蛋白是人体固有蛋白质之一 ,在皮肤里的含量最多 .胶原蛋白由于固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性、促新细胞形成及促上皮细胞形成功能 ,在医学领域、美容、化妆品、保健品行业的潜在用途不断拓宽 .但是 ,动物体胶原蛋白是一种硬蛋白 (水不溶 ) [1] ,并且随着年龄的增长内部双键越来越多 ,同时也越来越硬 .一般经酶解获得的胶原蛋白为水不溶性蛋白 ,也不可能在不改变分子量的情况下重溶解 ,因此可加工性很弱 ,直接限制了许多潜在用途的开发 .另外 ,来自动物体的胶原蛋白不可能排除病毒隐患 ,同时始终带有牛胶原的特性[2 ,3] ,…     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

透明颤菌血红蛋白基因和λ噬菌体裂解基因在生产PHB重组大肠杆菌中的同时表达

Exogenous Vitreoscilla globin gene (vgb), lytic genes of phage γ with S amber mutation (S^-RRz) and poly(fl-hydroxybutyrate) (PHB) biosynthetic genes (phbCAB) were cloned into a same Escherichia coil cell,simultaneously or respectively. Six novel strains containing phbCAB and vgb with or without lytic genes were constructed. Strain VG1 (pTU14), in which vgb, phbCAB and S-RRz could all be successfully expressed, has superior characteristics in cell growth and PHB accumulation, while the results of strains containing vgb and phbCAB without S- RRz were not better than that of strains harbored phbCAB only. The simultaneous expression of vgb and S-RRz in the recombinant VG1 (pTU14) showed a great potential for low-cost production of PHB.     

pH响应性P(AA-co-C8PhEO10Mac) 水凝胶的制备及其对L-抗坏血酸的控释性能

采用自由基交联共聚法合成了具有pH敏感性的水凝胶聚丙烯酸-co-甲基丙烯酸辛基酚聚氧乙烯醚酯〔P(AA-co-C8PhEO10Mac)〕,考察了不同单体配比的水凝胶在不同pH的缓冲溶液中的溶胀性、溶胀动力学和退溶胀动力学。通过浸泡法在水凝胶中载入L-抗坏血酸,初步研究了模拟胃肠液中,凝胶对L-抗坏血酸的释放行为。结果表明,凝胶兼具快速的溶胀和退溶胀速率,良好的pH敏感性等特征;载药凝胶在模拟肠液(SIF,pH=7.4)中对药物的累计释放率明显大于在模拟胃液(SGF,pH=1.4)中的累计释放率,增大丙烯酸的用量使累计释放率先升高后降低。采用滤纸片法研究了甲基丙烯酸辛基酚聚氧乙烯醚酯(C8PhEO10Mac)对大肠杆菌、酿酒酵母的抑制作用,结果显示,在10～50 mmol/L的测试浓度水平,C8PhEO10Mac对二者均无明显的抑制作用。     

基于pH恒定补糖的生物基丁二酸高效合成

通过确定大肠杆菌在产酸阶段葡萄糖的消耗与酸中和剂碳酸钠间的定量关系,建立了pH恒定补糖策略,能够使发酵液中葡萄糖浓度维持在稳定水平。与分批发酵相比,采用pH恒定补糖且维持葡萄糖浓度在较低的水平对丁二酸的积累是有利的。当采用pH恒定补糖并控制葡萄糖质量浓度在10g/L时,丁二酸最终质量浓度达到57.6 g/L,生产效率达到1.15 g/(L·h)。     

大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的克隆与表达优化

为了在大肠杆菌中表达大肠杆菌丙酮酸脱氢酶,用PCR法从大肠杆菌总DNA中克隆了pdc基因,将其插入载体pGEX-KG后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现了表达.通过对表达条件的优化,在TB M9(1∶1)培养基中,33℃下使用终浓度0.5 g·L-1的乳糖诱导4 h,重组大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的表达量可占全菌蛋白的45%左右,比未优化前提高了约20%,同时大大降低了成本.