代谢工程改造大肠杆菌利用脂肪酸合成己二酸

己二酸作为生产尼龙、化纤和工程塑料等聚合物的单体,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,己二酸的生物合成主要利用可食用原料,碳原子损失较多,造成己二酸产率较低。为解决上述问题,设计和重构以脂肪酸为原料的己二酸合成新路径,提高己二酸的理论得率;其次,强化本源的β-氧化路径和引入异源的ω-氧化路径;增强细胞对脂肪酸的利用能力;再次,借助系统代谢工程策略,进一步优化己二酸合成路径。最后,经发酵条件优化,最优工程菌Escherichia coli AA0304能够产生1.32 g/L己二酸。上述研究结果为利用废弃脂肪酸类化合物生产高价值化学品奠定了良好的基础。     

大肠杆菌中吡咯喹啉醌合成途径的构建

目前吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）在大肠杆菌中的异源合成主要以质粒为表达载体进行,但是质粒载体难以进行合成途径多基因表达的系统优化,并且容易造成发酵不稳定。作者以大肠杆菌为底盘生物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在基因组水平系统优化PQQ的合成。将来源于Gluconobacter oxydans 621H的操纵子pqqABCDE引入底盘大肠杆菌,并进一步通过优化合成途径基因表达强度,敲除大肠杆菌自身抑制基因及强化PQQ的胞内需求与胞外转运等,获得了一株能够高效合成PQQ的工程菌,摇瓶发酵72 h时产量达到86.3 mg/L。以大肠杆菌为底盘构建PQQ高效合成途径的工作能够为后续以其他底盘生物生产PQQ及相关代谢产物提供借鉴。     

家禽大肠杆菌诊治介绍

<正>1前言近些年来,养殖鸡群中大肠杆菌病流行情况最为显著,临床发病率、致死率居高不下,很多地方开始有爆发性、流行性趋势,对于地方家禽养殖的危害是甚为惨重的,造成的经济损失更是非常严重。此病是由多种血清型的致病性大肠杆菌引起的不同禽病类型的总称,其中包括了大肠杆菌气囊炎、败血症、脐炎、输卵管炎、大肠杆菌肉芽肿等等。这种疾病是由埃希大肠杆菌引起的一种常见病,典型症状表现为心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎等等。文章     

海藻酸钠-聚乙烯醇-活性炭共固定化重组大肠杆菌细胞

目的:研究产酸性磷酸酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET28b-AP/PT固定化制备条件以及固定化细胞的酶学特性。方法:比较9种细胞固定化方法,海藻酸钠-聚乙烯醇-活性炭共固定化为最佳方法;优化凝胶组成、菌体包埋量和固定化时间等条件,比较固定化细胞和游离细胞的酶学性质。结果:最适共固定化条件是:活性炭质量分数1.0%,海藻酸钠质量分数2.0%,聚乙烯醇质量分数6.0%,Ca Cl2质量分数2.0%,菌体包埋量6 g/100 m L凝胶溶液,固定化时间6 h。固定化细胞的酸性磷酸酶最适作用温度为35℃,比游离细胞提高5℃;固定化细胞与游离细胞的酸性磷酸酶最适作用p H均为5.0,固定化细胞显示出比游离细胞更宽泛的p H适应性。固定化细胞在重复使用12批后相对酶活力为54.5%,具有良好的操作稳定性。结论:海藻酸钠-聚乙烯醇-活性炭共固定化是非常适合固定化重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET28b-AP/PT的方法。     

食源性致病菌快速检测试剂盒的研制与应用

目的:研制1种快速检测沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7和金黄色葡萄球菌的三重PCR检测试剂盒,并加以应用。方法:设计3种待检目的菌特异性引物,优化PCR反应条件,建立多重PCR检测试剂盒,并对其特异性、灵敏度、抗干扰性、准确性等方面进行评估。结果:该试剂盒特异性好,灵敏度高,3种待检目的菌在不同食品介质中的检出限均达到101CFU/mL,抗干扰性强。在6个月保存期内,其稳定性和准确性均未发生改变。结论:本研究建立的试剂盒可同时检测上述3种病原菌,且具有稳定性好、准确性高等特点,可用于禽肉及其制品的日常微生物安全监测。     

利用内源性插入序列IS1构建thyA缺陷型大肠杆菌

为获得由大肠杆菌内源性IS1序列插入胸腺嘧啶合成酶基因thyA而产生的胸腺嘧啶营养缺陷型的菌株,利用4%的葡萄糖和1.25μg/mL链霉素的培养基提高IS1的插入频率,以三甲氧苄胺嘧啶(TMP)法定向筛选thyA缺陷型菌株。通过PCR扩增与DNA测序分析突变基因的结构;测定thyA缺陷型菌株在含或不含胸腺嘧啶的基础培养基上的生长曲线以研究其生长特性;转化大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体衍生的含外源thyA基因的互补质粒pMG36e-thyA,采用抗生素抗性基因与质粒上互补的thyA基因两种方法筛选转化子,检测突变菌株在基础培养基上的恢复生长情况。诱导增加IS1的转座频率后,以含3μg/mL的TMP的GSCTt筛选培养基得到thyA缺陷型菌株,将该菌株命名为D8。PCR扩增结果显示,该突变株的thyA基因比正常基因长约800bp,测序结果显示该基因内部插入了完整的IS1序列。D8菌株需依赖外源胸腺嘧啶才能在基础培养基上生长,当转化入pMG36e-thyA后,可利用质粒上的互补基因恢复在基础培养基上的生长性能。大肠杆菌内源性插入序列IS1可插入thyA内部使该基因沉默,为利用内源性插入序列构建缺陷型菌株提供了科学基础。     

茂原链霉菌转谷氨酰胺酶基因工程菌的构建及表达

目的:构建高产转谷氨酰胺酶且具有活性的基因工程菌。方法:以茂原链霉菌总DNA为模板,利用PCR技术扩增目的基因,构建重组质粒pET-22b-MTG,使其在大肠杆菌中得到高效表达并优化表达时间和温度。结果:成功构建产转谷氨酰胺酶的基因工程菌,酶活为15.9 U/mL,最优表达时间5 h,温度25℃。结论:成功构建TG基因工程菌,TG基因在大肠杆菌中得到高效表达,为后续试验提供原材料,为微生物发酵生产TG打下基础。     

桑白皮甾醇对亚硝酸盐的清除效果及抑菌活性研究

为了探索桑白皮甾醇的功能,首先测定在不同的甾醇质量浓度、反应时间、反应温度和pH值条件下桑白皮甾醇对亚硝酸盐的清除效果,结果显示质量浓度为0.80 mg/mL桑白皮甾醇溶液对亚硝酸盐清除率达到72.65%;在此浓度下进行的单因素试验结果表明,当反应时间60 min、反应温度65℃、pH值3.0时,桑白皮甾醇对亚硝酸盐的清除率分别达到最大值。接着,初步探讨桑白皮甾醇的抑菌活性及作用机制,采用滤纸片法观察桑白皮甾醇对不同细菌和霉菌的影响,并测定桑白皮甾醇对大肠杆菌生长曲线、菌体蛋白、电导率的影响。结果显示桑白皮甾醇对大肠杆菌的MIC值为10.0 mg/mL,其对大肠杆菌的菌体分裂、对菌体蛋白的正常代谢都有明显抑制,且引起细胞膜通透性变化,这些都表明桑白皮甾醇能抑制大肠杆菌生长。     

微液滴适应性进化强化大肠杆菌耐受高浓度L-山梨糖

前期研究构建了1株组成型表达山梨糖脱氢酶(sorbose dehydrogenase,SDH)的大肠杆菌工程菌,该菌株能利用L-山梨糖生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG),但对底物L-山梨糖的耐受性较差。为解决这一问题,对该菌株进行适应性进化,并强化了进化菌株发酵生产2-KLG的能力。首先,应用基于微流控技术的全自动高通量微生物液滴培养系统,将出发菌株在不同浓度梯度的L-山梨糖培养基中生长、传代,获得能够耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株。在摇瓶上进一步验证,最终获得了1株能耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株2-F6。然后在2-F6中共表达了能促进2-酮基-L-古龙酸积累的山梨酮脱氢酶(sorbosone dehydrogenase,SNDH),并在摇瓶水平上对接种量、发酵温度、SNDH诱导时间、IPTG诱导浓度以及L-山梨糖添加量进化了优化,在最优条件下,2-KLG的产量达6. 05 g/L。最终,将摇瓶发酵条件放大至5 L发酵罐后,2-KLG的产量为5. 70 g/L。研究结果为一菌一步发酵法生产维生素C前体2-KLG提供了参考。     

壳寡糖抑菌性能的研究

采用牛津杯法和共培养法研究壳寡糖对鸡源、猪源大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）及乳酸菌的抑制作用。结果表明,牛津杯法未检测到壳寡糖对病原菌的抑制作用;共培养法证实质量浓度为0.1 g/mL、0.2 g/mL和0.5 g/mL的壳寡糖对鸡源、猪源大肠杆菌和沙门氏菌均具有显著的抑菌作用（P＜0.05）,且随着壳寡糖质量浓度的升高,抑菌能力逐渐增强;0.2 g/mL的壳寡糖与乳酸菌共培养24 h对乳酸菌活菌数的影响不显著（P＞0.05）。为开发具有抑制畜禽肠道病原菌生长、预防腹泻等作用的复合壳寡糖- 乳酸菌产品提供理论基础。