成团泛菌苯丙氨酸氨基变位酶的性质表征及用于合成β-苯丙氨酸

克隆来源于Pantoea agglomerans的苯丙氨酸氨基变位酶基因(pam),构建表达载体,转入大肠杆菌中进行异源表达,采用亲和层析制备电泳纯的重组酶(PaPAM),用于催化合成β-苯丙氨酸。结果表明:成功克隆得到基因pam,长度为1626bp,编码541个氨基酸长度的PaPAM,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-pam,转入E.coliBL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和层析纯化获得电泳纯的重组PaPAM。MS和NMR表征结果表明,重组PaPAM能异构化a-苯丙氨酸为β-苯丙氨酸,在最适条件下(30℃、pH 9、1.5 mol/L NH_4~+),酶活力达到2.5 kU/g,在30～50℃、pH 8～10下PaPAM具有较高的稳定性,金属离子Na~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(3+)对PaPAM的活性影响较小,表面活性剂SDS和Triton100对PaPAM有较强抑制作用,在最佳反应条件下,底物的转化率达到92%。     

表达磷酸转移酶工程菌整细胞催化肌苷5′-位磷酸化的工艺条件研究

本文利用构建的表达产气肠杆菌酸性磷酸转移酶phoc基因的E.coli BL21,对其整细胞催化肌苷5′-位磷酸化的工艺条件进行了研究。研究结果表明在整细胞PHOC酶活、肌苷和焦磷酸浓度分别为45 U、100 mM和120 mM时,反应6 h肌苷转化率达到63.36%。为进一步提高转化率,研究了3种表面活性剂对整细胞肌苷转化率的影响,在Trion-x-100浓度为0.3%时,肌苷转化率提高到74.59%。该研究为酶催化肌苷5′-位磷酸化的工业化进程提供了技术支持。     

2017—2021年河南省肉与肉制品食源性致病菌监测及部分肠杆菌耐药特征分析

目的 了解河南省肉制品中食源性致病菌的污染状况,并对肠杆菌进行血清学分型和耐药特征分析。方法 收集2017—2021年河南省郑州市等21个监测点的1 934份肉与肉制品,参考《国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》和《河南省食品微生物风险监测工作手册》进行沙门菌、致泻大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌等7种食源性致病菌的检测,使用微量肉汤稀释法对致泻大肠埃希菌和沙门菌进行药敏试验,分析耐药率和耐药谱等特征。结果 1 934份样品中检出478株致病菌,其中沙门菌96株,共26个血清型,以肠炎沙门菌为主;致泻大肠埃希菌82株,以肠集聚性大肠埃希菌为主;产气荚膜梭菌68株,小肠结肠炎耶尔森菌38株,空肠弯曲菌33株,单核细胞增生李斯特菌140株和金黄色葡萄球菌21株。致病菌总检出率为24.72%,调理肉制品检出率最高达到89.00%,其次为生禽肉（36.79%）和生畜肉（22.35%）。96株沙门菌对氨苄西林（71.88%）、萘啶酸（63.54%）及四环素（58.33%）高水平耐药;82株致泻大肠埃希菌对四环素（84.38%）、...     

基于多壁碳纳米管/SDBS/硫堇阪崎肠杆菌免疫传感器的研究

目的:研制一种灵敏度高、电化学性能稳定的免疫传感器,构建准确检测阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii,E.sakazakii)的电化学方法。方法:将硫堇(Thi)、辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体(HRP-anti-E.sakazakii)依次自组装固定于多壁碳纳米管(MWCNT)/十二烷基苯磺酸钠(SDBS)修饰的四通道丝网印刷电极上,制得一次性免疫传感器。采用原子力显微镜(AFM)表征电极修饰和孵育抗原后的表面形态,用循环伏安法(CV)考察不同修饰电极的电化学特性,根据还原峰电流的变化对阪崎肠杆菌进行测定。结果:在优化的实验条件下,该方法检测阪崎肠杆菌的线性范围为102～108cfu/mL,检测限为5.7×101cfu/mL(S/N=3)。结论:该免疫传感器灵敏度很高,具有较好的特异性、重现性(RSD=6.3%)、稳定性(4℃无菌容器中放置15d后电流响应为初始值的93.24%)和准确性(与GB/T4789.40-2010符合率为96.67%),具有一定的应用潜力。     

恒温实时荧光法快速检测奶粉中阪崎肠杆菌方法的建立

为实现奶粉中快速检测阪崎肠杆菌,本文建立了检测阪崎肠杆菌的恒温实时荧光法。针对阪崎肠杆菌16S r RNA设计三组LAMP引物,采用Deaou-308C恒温实时荧光检测平台,选取常见病原菌标准株进行引物特异性检测;选取阪崎肠杆菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定,同时利用人工污染方式检测此方法在脱脂和全脂奶粉中的灵敏度和最低检测限,利用Real Amp法和国标法对20份市售奶粉进行对比实验。结果显示,引物组16S-11扩增效率最优,与常见病原菌无交叉反应,对阪崎肠杆菌基因组DNA、阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的灵敏度分别达到102 CFU/m L、102 CFU/m L和103 CFU/m L;对阪崎肠杆菌基因组DNA和阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的最低检测限分别达到103 CFU/m L、103 CFU/m L和104 CFU/m L;在20份市售奶粉样品中Real Amp检测结果与传统国标培养结果一致,表明本文建立的阪崎肠杆菌Real Amp检测方法适用于阪崎肠杆菌的快速检测。     

阴沟肠杆菌铁氢酶（hydA）基因在大肠杆菌中的表达及其产氢特性

合成Enterobacter doacae ⅡT-BT 08的铁氢酶(hydA)基因片段,PCR扩增出全长ORF.将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,构建了表达质粒pGEX-4T-2-hydA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并在IPIG诱导下表达.SDS-PAGE分析表明在约42kDa处有特异性条带.用抗GST多克隆抗体对GST-hydA融合蛋白进行了Western blot检测,进一步证明了hydA得到了正确的融合表达.产氢活性检测结果表明表达的重组hydA在大肠杆菌中具有明显的产氢活性.测定了培养基初始pH值、温度和底物浓度对重组大肠杆菌产氢的影响.     

肠杆菌科细菌生化鉴定系统的研制及评价分析

目的 探讨肠杆菌科细菌生化鉴定系统的研制并对其性能进行评价。方法 细菌鉴定采用常规API微生物鉴定系统(对照组)与我院自制观察系统(观察组),将自行研究的生化基质置聚苯乙烯条中脱水制干组合成鉴定条,辅以细菌编码技术,对120株临床菌株进行鉴定,并与API鉴定结果进行比较。结果 11株标准菌株接种于本系统,8～24h的观察结果符合率为92.4%～98.6%.本系统与API2种方法鉴定技术水平的符合率为95%,经检验两者间无显著性差异(P>0.05)。结论 新研制系统鉴定肠杆菌科细菌快速、简单,能很好的为临床提供准确实验依据。     

两批次婴儿配方奶粉阪崎肠杆菌不合格

近日，广东省工商局公布2012年一季度全省流通环节乳制品、含乳食品抽样检验结果，整体合格率为98．9％。不过，有两批次婴儿配方奶粉检出含有致病菌“阪崎肠杆菌”，中国奶业协会原常务理事、乳业专家称，该病菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和败血症，死亡率高达50％以上。     

提高食品中阪崎肠杆菌的阳性检出率

阪崎肠杆菌对食品的污染具有微量和高度不均一性的特点，使得该菌能“逃避”食品卫生微生物学的检验。以国内生产的婴儿配方乳粉为样品，采用荧光定量PCR法和分离计数法分别进行检验，对影响检出率的主要因素进行比较和讨论。结果表明，样品中的阪崎肠杆菌分离株主要有6秕生化型，X—α—GlcA琼脂的选择分离效果优于其它培养基。荧光定量PCR法有一定的假阳性率。同一批次样品不同包装间的个体差异较大。而且在同一样品中，常常套同时检出阪崎肠杆菌的不同的生化型或亚种。要挑取足够多的菌落用于生化鉴定。